Содержание

Осложнения стоматита у детей — детской стоматологии УткинЗуб

Многие родители теряются, когда узнают: у ребенка стоматит, что делать? Конечно, сразу же находится много советчиков, вернее, советчиц, которые уверенны, что они лучше всех знают, как лечить молочницу и все другие существующие детские заболевания.

Виды стоматита и способы его лечения

Мы не против народной медицины и бабушкиного опыта, но как бабушка будет знать, какой вид стоматита у вашего малыша. А лечение зависит именно от этого.  Если есть вирусный герпесный стоматит у детей  – лечение совершенно иное, чем у молочницы. А  аллергический стоматит вообще требует особого и очень ответственного подхода, потому что от адекватности избранной терапии может зависеть даже жизнь малыша. Неправильно леченный стоматит может привести к большим осложнениям. Наиболее распространенным осложнением стоматитов всех видов может стать вторичное инфицирование (стафилококковое или стрептококковое). Ведь стоматит приводит к поражению защитной слизистой оболочки и, по сути, у малыша во рту – открытые раны, через которые любая инфекция попадает прямо в организм и разносится потоком крови. Возникает так называемая стрепто-стафилококковая пиодермия – поражения кожи лица, тела, рук с множественными гнойными язвами, высыпаниями, панарициями, которые подсыхая, образуют желтые или коричневые корочки. Это серьезное заболевание, которое очень трудно лечится.

Также возможны очень серьезные осложнения в случае аллергического стоматита. Он сам по себе трудно лечится и возможно нарастание воспалительного процесса. Это может привести к отеку Квинке, или анафилактическому шоку, во время которых наблюдается остановка работы маленького сердечка и остановка дыхания,  возможна и  смерть, если помощь не подоспеет вовремя.  Не хотим вас дальше пугать. Серьезные осложнения случаются редко, потому что большинство родителей очень ответственно относятся к малейшим проявлениям воспалений у своих малышей. Лечить

стоматит у маленьких детей надо обязательно, лечить профессионально, не доверять здоровье своих любимых детей сомнительным советам.

Острая зубная боль: причины, последствия, лечение

От острой зубной боли никто не застрахован, она появляется вследствие повреждения зубного нерва или мягких тканей рядом с ним. В связи с этим появляются такие заболевания, как периодонтит, пульпит и кариес.

Выявление причин острой зубной боли:

·        Кариес.

Глубокая степень этого заболевания пагубно влияет на состояние ротовой полости в целом и каждого зараженного зубного элемента по отдельности. Острая зубная боль начинает проявляться под воздействием определенных раздражителей, например: некачественное пломбирование зуба, трещина зуба.

·        Пульпит.

В данном случае, боль проявляется во время приема пищи, когда на дентин попадают слишком острые, холодные, сладкие и горячие продукты/вода. Кроме того, пульпит может беспокоить вашу полость рта и в состоянии покоя, чаще можно наблюдать обострения в ночное время.

Симптомы и последствия острой зубной боли:

Боль может проявляться, как приступами, так и затяжными ноющими симптомами. Прикосновение к зоне поражения может усилить боль в разы, поэтому не рекомендуем без надобности дотрагиваться до зуба. Делайте это только при необходимости его пополоскать или помазать стоматологическим кремом.

Если вы ощущаете боль в области уха и виска, необходимо обратиться к врачу как можно скорее, так как терпеть долго такое раздражение вам будет все сложнее.

Пульсирующая боль и припухлость проявляются при абсцессе зуба. В таком случае это уже не только воспалительное, но и инфекционное поражение, по причине которого образуется гнойная полость в области зуба. В данном случае категорически нельзя заниматься самолечением, так как неверно подобранные лекарства могут только усугубить положение, последствием чего может стать хирургическое вмешательство и потеря зуба.

Лечение острой зубной боли:

Для того, чтобы произвести качественное лечение пораженного зуба, необходимо провести его диагностику. Специалисты нашего стоматологического центра, опираясь на ваши жалобы и симптомы произведут диагностику и обеспечат быстрое и эффективное лечение.

Если пульпит или кариес послужили причиной вашей острой боли, проводятся манипуляции по устранению очага заболевания, после чего производится пломбирование каналов и реставрации коронковой части зуба.

Когда нет возможности посетить врача, рекомендуем осуществить действия, которые временно отложат вашу проблему и не повлекут за собой негативных последствий, пока вы не сможете записаться на прием. Для начала тщательно почистите зубы, чтобы из пораженной зоны удалить все остатки пищи. После этого не лишним будет прополоскать ротовую полость содовым раствором. Важным моментом является следующее: исключите все таблетированные препараты, которые могут попасть в зону поражения зуба, так как может произойти ожог слизистой. Пользуйтесь такими средствами, как: ацетилсалициловая кислота, ибупрофен или любой другой анальгетик.

Рекомендации:

Все же мы рекомендуем, при обнаружении острой зубной боли, обращаться непосредственно к врачу, чтобы не усугубить положение. Наши специалисты стоматологического центра «Династия-С» в Ростове-на-Дону работают для вас даже в столь трудное время, когда из-за вспышки COVID19 запрещено работать. Врачи и хирурги выходят в дежурном режиме, чтобы избавить пациента от боли и провести все необходимые манипуляции.

В нашей клинике каждый час проводится дезинсекция полов, столов, дверных ручек и всех поверхностей, включая приборы. Каждый член персонала одет в маску, очки, шапочку, перчатки и медицинский халат. Поэтому вы можете быть уверены в том, что с нами вирус вас не страшен!

Стоматит — лечение, симптомы, диагностика, последствия

Стоматит — воспалительное заболевание, поражающее слизистую оболочку ротовой полости. Проявляется в виде язвенных образований с налетом беловатого цвета, сопровождающиеся болевыми ощущениями в местах повреждения, отечностью. Существует несколько причин возникновения:

  • атака лейкоцитов на не распознанные молекулы;
  • плохая гигиена полости рта;
  • заболевания желудочно-кишечного тракта;
  • инвазия глистами.

В некоторых случаях у человека выделяется повышенное количество слюны, кровоточат десна.

  1. Как лечить
  2. Какую диагностику проходить
  3. Последствия

Как лечить стоматит

Стоматитное воспаление затухает в течение недели. Медикаментозные препараты подбираются в зависимости от характера возбудителей. Разновидность определяется стоматологом, терапевтом. Учитывая результаты обследования, назначают противогрибковые, противовирусные или другие лекарства. Чаще всего назначают процедуру полоскания. Используют антисептические ополаскиватели на основе травяных настоек. Средства с анестезирующими свойствами уменьшают боль. Также применяют леденцы, содовые растворы.

Какую диагностику проходить при стоматите

После возникновения симптомов стоматита, пациент обращается за помощью к специалисту. Изучив информацию в медицинской карте, доктор приступает визуальному обследованию ранок. Специфические тесты на выявление стоматита не применяются. Определяют диагноз по внешнему состоянию, расположению язвенных поражений, повторяющейся динамике развития. Дополнительных симптомов (высокой температуры, ухудшения самочувствия, головокружение, нарушения координации) нет. При запущенной форме возникает множество ранок, вследствие инфицирования повышается температура.

Последствия стоматита

Болезнь не коварная, протекает в течение семи дней. Нарушений в функциональности жизненно важных органах человека не наблюдается. Однако, при возникновении провоцирующих факторов стоматит появляется повторно. Бактерии, вирусы, плохое питание, вредные привычки, опухоли, повреждения слизистой предрасполагают к развитию воспалительных процессов.

что это? Причины, симптомы, принципы лечения

Как же протекает вирусный стоматит? Он обостряется на фоне респираторно-вирусных заболеваний. Они, кстати, могу вызывать активизацию вируса герпеса. Заболевание обычно продолжается 7-10 дней. Признаки характеризуются общим недомоганем. Появляются головные боли, дискомфортные ощущения в мышцах. Слизистая полости рта краснеет и отекает, увеличиваются поднижнечелюстные лимфатические узлы. Через несколько дней от начала заболевания на языке, внутренней поверхности щек возникает пузырьковая сыпь, а внутри высыпаний находится полупрозрачная жидкость. После вскрытия пузырьков появляются мелкие эрозии, которые сверху покрыты желтоватой пленкой. При тяжелом течении высыпания появляются на губах и лице.

Катаральный стоматит сопровождается покраснением и отечностью слизистой ротовой полости. Боль во время еды обычно умеренная. Возможно появление кровоточивости десен. При катаральном стоматите слюнотечение немного повышается, температура тела у взрослых остается в пределах нормы, а у детей возможно появление кратковременной лихорадки в первые несколько дней от начала болезни. Если отказываться от эффективного лечения катаральной формы, существует риск перехода в другую стадию, когда образуются язвенные дефекты.

Аллергический стоматит во рту возникает на фоне обострения аллергии. Повышенная чувствительность организма может возникать на продукты питания, лекарственные препараты, пыльцу растений, шерсть животных, косметику и средства ухода и даже на одежду. Чаще всего стоматит провоцируют зубные пасты, которые содержат ароматизаторы, потенциально опасные химические компоненты. Основные признаки стоматита аллергической формы: сухость слизистой оболочки; снижение активности вкусовых рецепторов; зуд, жжение во рту; отечность и покраснение; боль во время жевания. Буллезная форма аллергического стоматита сопровождается образованием везикул, которые заполнены прозрачной жидкостью. При их вскрытии ротовая полость начинает кровоточить, покрывается фибринозным налетом. Язвочки во рту отличаются резкой болезненностью, и боль может усиливаться даже при разговоре.

Характерный признак язвенного стоматита — образование язв на фоне общей отечности и покраснения слизистой. Возможно появление жжения в области десен. Острый период продолжается несколько дней. Язвы сверху имеют серый налет. Слюнотечение при этом повышено, дыхание становится зловонным. В тяжелой форме язвенный стоматит сопровождается нарастанием лихорадки и резкой болезненности в полости рта. При ухудшении самочувствия необходимо сразу обратиться к стоматологу, чтобы вовремя выявить бактериальные осложнения и начать более серьезное лечение. Язвенно-некротический стоматит Венсана отличается тяжелым течением. Слизистая буквально за несколько дней покрывается язвами с плотными пленками желтого или зеленого цвета. Ткани вокруг дефекта красные и сильно воспаленные. Язвы часто распространяются и на слизистую языка. Воспаленные очаги склонные к слиянию, поражают глубокие слои тканей. При снятии налета на месте язвы образуется кровоточащая ткань. Хроническое течение язвенной формы стоматита часто приводит к стоматологическим заболеваниям, ЛОР-патологиям. Признаки афтозной формы Главный признак афтозного типа — появления афт на слизистой языка и губ. Полное восстановление тканей происходит за 2 недели. При неблагоприятном течении афтозный стоматит осложняется некротическим процессом, поражением протоков слюнных желез, глубокими язвенными дефектами. Но при правильном лечении заболевание протекает относительно легко и не требует назначения системных препаратов.

Язвенно-некротическая форма чаще появляется на фоне размножения нескольких инфекционных возбудителей. Специалисты выявляют преимущественно фузобактерии и спирохеты. Они вызывают сильные мышечные и головные боли, которые говорят о выраженной интоксикации. Больной жалуется на слабость, высокую температуру тела. Слизистая рта краснеет и кровоточит, постепенно изъязвляется с образованием очагов некроза в области десневых сосочков. 

Проверьте свои зубы после коронавируса

Недавно мы пережили не самый приятный период ограничительных мер, связанных с короновирусом. Сидение дома и малая физическая и социальная активность, нервная напряженность и эмоциональная неустойчивость, беспокойство и переживания не добавляют здоровья. Большинство из нас пережили стресс или находятся до сих пор в этом состоянии. Научно доказано, что стресс снижает иммунитет. Можно суверенностью сказать, что стресс и его последствия скажутся и на наших зубах. Именно поэтому необходимо как можно быстрее обратиться к своему стоматологу.

Как стресс влияет на зубы?

Важно отметить, что стресс может обострить хронические заболевания или стать причиной развития таких проблем, как преждевременное стирание зубов, повреждение эмали зубов и нарушение работы суставов челюсти. В стрессовом состоянии происходит перенапряжение мышц в области лица и шеи, отмечается ночная гиперактивность зубочелюстной системы. Ночное сдавливание зубов и скрежетание ими разрушают не только зубы, но могут стать и причиной головной боли. Из-за чрезмерного напряжения мышц может развиться дисфункция височно-нижнечелюстного сустава, которая проявляется щелчками в суставе, болью в висках и шее, ограничением амплитуды открывания рта.

В стрессовом состоянии часто отмечается сухость во рту, так как «гормон стресса» – кортизол — угнетает процесс образования слюны. Дефицит слюны приводит к недостаточному насыщению эмали зубов фтором и кальцием. Вместе с тем, в стрессе меньше вырабатывается «гормона радости» – серотонина, из-за чего сокращается количество витамина D, который также отвечает за усвоение кальция. Более того, кортизол вызывает спазм мелких сосудов, которые кровоснабжают и питают ткани, окружающие зуб. Постепенно эти ткани слабеют и становятся более уязвимыми к атакам микробов. Как следствие, развиваются кариес и болезни десен. Может появиться  неприятный запах изо рта.

Еще одним недугом, вызванным стрессом, является стоматит. На фоне сниженного иммунитета и нарушения питания тканей на внутренней стороне щек, губ и на деснах появляются болезненные язвочки, доставляющие серьезный дискомфорт.

Последствия стресса, причиной которого стал короновирус и карантинные мероприятия, могут выражаться в микротрещинах на зубах, скрытом воспалительном процессе, пульпите, многих других неприятных изменениях в зубочелюстной системе.

Срочный визит к стоматологу.

Чтобы предотвратить возможные последствия стресса, необходимо как можно быстрее запланировать визит к своему стоматологу, даже если вы были у него совсем недавно. Ксожалению, в негативных условиях мировой пандемии правило о посещении врача два разав год больше не работает – сейчас нам всем необходимо заново проверить свое здоровье. Заметить проблему на раннем этапе намного лучше, чем прийти с уже запущенным случаем и сильной болью. К тому же лечение своевременно выявленных проблем будет значительно дешевле, что тоже очень важно для пациентов.

Обязательно нужно поторопиться к врачу, если были проведены какие-то процедуры довведения карантина, например, удаление зубов или подготовка к протезированию. Необходимо проверить брекеты или иные стоматологические конструкции, профессиональный уход за которыми был невозможен из-за различных ограничительных мер.

Наконец, именно сейчас стоит задуматься и о гигиенических и косметических процедурах, которые были отложены на неопределенный срок. Красивые зубы придадут человеку уверенность и помогут более легкому выходу из состояния стресса.

Безопасность – прежде всего!

Несмотря на ослабление режима, который был введен из-за пандемии, врачи по-прежнему придерживаются повышенных мер безопасности при лечении пациента. Мы уже рассказывали в предыдущей статье о том, какие методы защиты от инфекции мы применяем в нашей клинике и по-прежнему считаем безопасность врачей и пациентов своим приоритетом. В стоматологической клинике «Юсодент» используются маски, экраны, санитайзеры, проводится регулярная уборка и проветривание кабинетов после каждого пациента, – всё строго по нормам Минздрава и Роспотребнадзора. Мы ведем прием по записи и сохраняем необходимую социальную дистанцию между пациентами.

К сожалению, есть большая вероятность того, что мир ждет вторая волна коронавируса и новые строгие ограничительные меры, поэтому мы настоятельно рекомендуем серьезно отнестись к своему здоровью и здоровью своих зубов.

Вадим Владимирович Рощин, директор стоматологической клиники «Юсодент».

Стоматит — обзор | ScienceDirect Topics

Стоматит, изъязвления и экссудаты

Стоматит, который никогда не следует называть архаичным и непрофессиональным термином «ротовая гниль», часто встречается у змей и черепах, но редко у ящериц. Обычно это происходит в результате плохих условий содержания, включая субоптимальную температуру, недоедание и скученность. Стоматит может быть вызван различными бактериями, вирусами или грибками. Часто развиваются воспаление, изъязвление, абсцесс и казеозные отложения.Пневмония и септицемия часто сопровождаются стоматитом.

Экспозиционный гингивит часто принимают за стоматит. Ящерицы, которые имеют или имели MBD, обычно имеют деформированные нижние и верхние челюсти, что приводит к обнажению тканей десны. Это состояние также наблюдается при травматических дефектах губ. Пораженная десна образует сухой красновато-коричневый материал, похожий на струпья. Это состояние не отвечает на антибактериальную терапию. Обнаженную десну следует увлажнять вазелином и периодически удалять отделяемое.

Неоплазия полости рта наблюдалась у ящериц и может проявляться в виде изъязвленной массы. Химические или термические ожоги теоретически могут привести к язвам во рту. У ящериц с почечной недостаточностью язвы во рту обычно не развиваются. Висцеральная подагра может привести к воспалению полости рта.

Оральный экссудат обычно возникает в результате воспаления ротовой полости, дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта. Стоматит обычно сопровождается экссудацией. Белая или слизистая пена может выделяться при кашле при пневмонии.Реже содержимое желудка может регургитировать и попасть в ротовую полость в случаях гастрита или желудочно-кишечной непроходимости. Септицемия часто присутствует при стоматите, пневмонии и гастроэнтерите. Воспаление любых тканей вызывается бактериальными, вирусными, грибковыми и паразитарными агентами. Для дифференциации возбудителя необходим соответствующий диагностический отбор проб.

Хамелеоны ( Chamaeleo spp.) имеют дорсолатеральные от углов рта височные железы, которые иногда инфицируются и набухают казеозными остатками (рис. 39-8). 14 (см. главу 72.)

Стоматит, связанный с зубными протезами, связан с дисфункцией эндотелия

Воспаление полости рта, такое как периодонтит, может привести к дисфункции эндотелия, ускоренному атеросклерозу и сосудистой дисфункции. Взаимосвязь между сосудистой дисфункцией и другими распространенными формами инфекций полости рта, такими как стоматит, связанный с зубными протезами (DRS), неизвестна. Аналогичные факторы риска предрасполагают к обоим состояниям, включая курение, диабет, возраст и ожирение.Соответственно, мы стремились исследовать эндотелиальную функцию и основные факторы риска сосудистых заболеваний у 44 последовательных пациентов с зубными протезами с клиническими и микробиологическими признаками ДРС (1) и без ДРС (1). Несмотря на тенденцию к более высокой частоте диабета и курения, группы существенно не отличались в отношении основных факторов риска сосудистых заболеваний. Группы не различались по основному амбулаторному артериальному давлению, общему холестерину или даже СРБ. Важно отметить, что дилатация, опосредованная потоком (FMD), была значительно ниже у пациентов с DRS, чем у пациентов без DRS, в то время как нитроглицерин-индуцированная вазорелаксация (NMD) или толщина интима-медиа (IMT) были одинаковыми.Интересно, что в то время как уровни триглицеридов были нормальными в обеих группах, они были выше у субъектов с DRS, хотя они не коррелировали ни с FMD, ни с NMD. Выводы . Стоматит, связанный с зубными протезами, связан с дисфункцией эндотелия у пожилых пациентов с зубными протезами. Отчасти это связано с тем, что диабет и курение увеличивают риск как DRS, так и сердечно-сосудистых заболеваний.

1. Введение

Воспаление полости рта является важным элементом патогенеза сосудистых заболеваний.В частности, в последнее время накопилось большое количество доказательств того, что хронический пародонтит является потенциальным новым фактором риска развития атеросклероза и эндотелиальной дисфункции [1–5]. Действительно, интенсивное лечение хронического пародонтита облегчает эндотелиальную дисфункцию при длительном наблюдении, при этом клиническая польза сохраняется до 6 месяцев после интенсивного лечения [6]. Механизмы этой ассоциации четко не определены, но, скорее всего, зависят от системной воспалительной реакции, включающей повышенные уровни ИЛ-6, СРБ, ФНО-альфа и других цитокинов, которые сопровождают пародонтит [6, 7].Кроме того, при пародонтите также активируется клеточный иммунитет, включая сдвиг субпопуляции моноцитов, а также активацию Т-клеток с гиперпродукцией гамма-интерферона и ИЛ-17 [8].

В то время как многочисленные исследования были сосредоточены на связи между пародонтитом и эндотелиальной дисфункцией, мало что известно о связи между другими формами инфекции полости рта и воспалением в контексте сердечно-сосудистого риска. В частности, зубопротезный стоматит (ДРС) представляет собой воспалительный процесс слизистой оболочки полости рта при контакте с зубным протезом и является одним из наиболее частых заболеваний у пациентов пожилого возраста, поражая в течение жизни до 70% пациентов [9, 10].Это наиболее часто встречается у тех, кто носит полные протезы, у лиц с полной адентией [9–11]. Потенциальные связи заслуживают особого внимания, поскольку основными факторами риска DRS являются курение, диабет, возраст и ожирение, которые совпадают с риском атеросклероза и сосудистых заболеваний [9, 12, 13]. Таким образом, еще более удивительно, что эта проблема одновременного возникновения обоих состояний до сих пор не изучена. Интересно, что связь DRS с дислипидемией неизвестна, а женский пол, по-видимому, предрасполагает к более частому возникновению [9].Клинические симптомы DRS включают эритему и отек слизистой оболочки неба, иногда в сочетании с субъективными симптомами, такими как дисгевзия или ощущение жжения. Этиология ДРС многофакторна [9]. Длительное и постоянное использование зубных протезов, а также неправильный уход за зубными протезами и гигиена полости рта способствуют развитию биопленки, называемой зубным налетом, на поверхности протеза [9, 12]. Candida albicans – грибковый компонент физиологической микрофлоры полости рта человека [14, 15]; однако указанные выше факторы могут способствовать его избыточному росту и, как следствие, развитию инфекции и ДРС.

В то время как при пародонтите системная активация иммунной системы очень важна для опосредования повышенного сердечно-сосудистого риска, степень системного ответа на DRS плохо охарактеризована. Системное воспаление может влиять на сосудистую дисфункцию несколькими способами, включая активацию моноцитов и Т-клеток с перепроизводством цитокинов, таких как интерферон γ , TNF-альфа, интерлейкин 6 или 17 [16], что впоследствии приводит к атеросклерозу и артериальной гипертензии [16]. 16–18] и повышенный сердечно-сосудистый риск.Интересно, что повышенный сердечно-сосудистый риск был показан также при кариесе [19–21], а также при эндодонтической инфекции [22–26]. Все эти заболевания вызываются бактериальными инфекциями, но другие микроорганизмы также способны инфицировать ткани полости рта. Взаимосвязь между грибковой инфекцией полости рта и системной воспалительной реакцией в контексте сосудистого риска еще не изучена. Таким образом, целью данного исследования было определить, совпадает ли наличие ДРС с клиническими показателями сосудистой дисфункции, такими как нарушение функции эндотелия или повышенное артериальное давление.

2. Методы
2.1. Пациенты

В это исследование были включены 44 последовательных пациента с зубными протезами в течение не менее 6 месяцев. Их слизистая оболочка рта была осмотрена стоматологом для клинического выявления воспаления и DRS. Клинические признаки воспаления слизистой оболочки полости рта при DRS включают эритему и отек слизистой оболочки неба, иногда в сочетании с субъективными симптомами, такими как дисгевзия или ощущение жжения. Эти наблюдения были подтверждены обычными микробиологическими лабораторными диагностическими тестами на наличие видов Candida .На основании клинических и микробиологических исследований пациенты были разделены на группу DRS () и группу без DRS (). Диагноз подтвердил независимый наблюдатель. Контрольная группа, пациенты без DRS, имели клинически здоровую слизистую оболочку полости рта и отрицательные мазки из полости рта на Candida . Клинически здоровая слизистая оболочка полости рта была бледно-розовой, гладкой слизистой оболочкой без покраснения или отека, без боли или дискомфорта, о которых сообщал пациент. Критерии исключения включали острые воспалительные заболевания, отличные от DRS, рецидивы неопластических заболеваний или курсы химиотерапии менее чем за 5 лет до включения в исследование, а также использование антибиотиков менее чем за 4 недели или противовоспалительных препаратов (стероидов и нестероидных, за исключением аспирина в дозах менее 80 мг). ) менее чем за 2 месяца до зачисления.Пациенты с инфарктом миокарда, острым коронарным инцидентом или воспалением сосудов в анамнезе за 5 недель или менее до включения, хроническими гематологическими нарушениями и иммунодефицитом или серьезной сменой лекарств в течение менее 5 недель до или во время исследования также были исключены. Исследование было одобрено локальным комитетом по этике Ягеллонского университета. От всех пациентов было получено информированное согласие, и вся работа проводилась в соответствии с Хельсинкской декларацией (1964 г.).

2.2. Микробиологические исследования

Мазки брали с твердого неба (между второй и третьей небными складками). Образцы собирали после ночного голодания и не менее 6 часов непрерывного ношения протезов без использования клея или полоскания рта дезинфицирующими средствами. Материал собирали в соответствии с общими принципами сбора микробного материала.

2.3. Клинические данные

Артериальное давление пациентов (систолическое, диастолическое) контролировали в течение 24 часов с помощью системы амбулаторного мониторинга артериального давления (СМАД; SpaceLabs , устройство Ultralite).Систолическое диастолическое и среднее артериальное давление регистрировали каждые 20 минут в течение 24 часов. Были рассчитаны дневные и ночные средние значения. Один пациент в контрольной группе не согласился носить монитор СМАД. Основные факторы риска как атеросклероза, так и DRS были зарегистрированы на основе медицинских карт пациентов и подробного анамнеза. Клинические факторы риска были определены следующим образом: гиперлипидемия (уровень общего холестерина плазмы > 5  ммоль/л и/или уровень триглицеридов > 1,7  ммоль/л), диабет (уровень глюкозы натощак ≥ 7  ммоль/л или HbA1c > 6.5% или текущее лечение инсулином или пероральными гипогликемическими средствами), артериальная гипертензия (артериальное давление ≥ 140/90  мм рт. ст. или текущее лечение антигипертензивными средствами) и курение (текущее или в течение последних 6 месяцев) на основании [27]. Образцы крови были получены из локтевой вены, и профиль липопротеинов был оценен с помощью обычных диагностических измерений триглицеридов, общего холестерина, фракций холестерина липопротеинов низкой (ЛПНП) и высокой (ЛПВП) плотности. Концентрацию С-реактивного белка (СРБ) также оценивали, как и при рутинной диагностике.

2.4. Измерение эндотелиальной функции

Метод Flow-опосредованной дилатации (FMD) использовался для определения функции эндотелия сосудов, а NMD (нитроглицерин-опосредованная дилатация) — для измерения эндотелиально-независимой вазодилатации. Измерения проводились с помощью диагностической ультразвуковой системы Toshiba Xario через 1, 2 и 4-5 минут после сдувания манжеты манометра или сублингвального введения нитроглицерина и представлялись в процентах от диаметра артерии до вмешательства.Валидация метода в нашей лаборатории описана в другом месте [28]. Наблюдатели были ослеплены в отношении орального статуса пациентов.

2.5. Оценка субклинического атеросклероза

Измерения толщины комплекса интима-медиа проводились в 12 различных точках (на 2 см ниже луковиц общих сонных артерий, примерно через каждый 1 см, исключая видимые коронарные бляшки), на правой и левой общих сонных артериях, измеряя расстояние между границей между просветом артерии и интимой сонной артерии и второй яркой линией-m (граница между медией и адвентицией), как описано ранее [28].

2.6. Статистический анализ

Анализ был выполнен с использованием программного обеспечения Statsoft Statistica. Соответствие распределения переменных нормальному распределению проверяли критерием Шапиро-Уилка. Большинство переменных не имели нормального распределения, поэтому результаты представлены в виде медиан и 25-го ( Q 1), 75-го ( Q 3) процентилей. Для этих переменных использовались непараметрические статистические тесты, критерий Манна-Уитни для непрерывных переменных или, для дихотомических переменных, для ожидаемых частот > 5 или с поправкой Йейтса для ожидаемых частот < 5 с подтверждением точного критерия Фишера и корреляции Спирмена.Для переменных с нормальным распределением был применен критерий Стьюдента, и данные представлены как среднее значение со стандартным отклонением (SD). Для каждой переменной в тексте дается способ представления результатов. Значения считались статистически значимыми.

3. Результаты
3.1. Клинические факторы риска в исследуемых группах

Обе группы были сбалансированы по возрасту, полу, величине индекса массы тела (ИМТ) и антигипертензивной терапии. Курильщиков и больных сахарным диабетом (СД) в группе ДРС было больше, чем в контрольной группе, хотя эти различия не были статистически значимыми.Более высокая распространенность СД и курения в группе ДРС согласуется с эпидемиологическими данными и понятна, поскольку оба фактора признаны факторами риска развития ДРС [13]. Доля мужчин в обеих исследуемых группах была ниже, чем ожидалось для общей популяции, что согласуется с эпидемиологией ДРС, который чаще встречается у женщин [9]. Характеристики пациентов суммированы в таблице 1.

9 0077
6 (30%) 90 (8,083%) 17 (85%)
DRS Group


гендер (M: F) 2 : 18 0,05 6: 18 6: 18
Среднее возраста (SD)] 63,9 (6,6) 0,05 65,9 (10,3)
ИМТ медиана (; )] 28,5 (24,9; 33,6) 0,05 27,8 (24,3; 29,3)
Курение (%) 3 0,05 3 (12,5%)
Сахарный диабет (%) 6 (30%) 0,05
Гипертония
17 (85%) 0,05 19 (79,2%)
Гиперлипидемия (%) 13 (65%) 0,05 9008 3 12 (50%)
Medications (%)
ACE Ингибитор 7 (35%) 0,05 12 (50%)
Ацетилсалициловая кислота 3 (15%) 0,05 4 (17%)
-Blocker 7 (35%) 7 (35%) 0,05 10 (42%)
Artagist CA 3 (15%) 0,05 8 (34%) 8 (34%)
(35%) 0,05 0,05 6 (25%)
Statin 6 (30%) 0,05 5 (21%)
INSULIN 2 (10%) 0,05 2 (8,3%)
oral противодиабетические средства 2 (10%) 0,05 2 (8,3%)

АПФ: ангиотензинпревращающий фермент, ИМТ: индекс массы тела, СД: сахарный диабет, SD: стандартное отклонение.
3.2. Артериальное давление при стоматите, связанном с зубными протезами

Амбулаторный мониторинг артериального давления не показал существенных различий как в среднем систолическом, так и в среднем диастолическом артериальном давлении в DRS и контрольной группе без DRS (рис. 1). Более того, последующий анализ артериального давления в периоды активности и отдыха также не показал существенных различий (данные не представлены).


3.3. Сосудистая функция

Измерения дилатации, опосредованной потоком, показали значительно сниженный средний процент артериальной дилатации в ответ на поток в группе DRS по сравнению с контрольными пациентами (рис. 2).В то же время не было различий между группами по эндотелийнезависимой вазодилатации, НМД (рис. 2). Не было различий в исходном диаметре сосудов между контрольной группой и группой DRS (  мм против   мм; ).


3.4. Субклинический и клинический атеросклероз

Оценка толщины комплекса интима-медиа не выявила существенных различий ни в максимальном, ни в среднем ТИМ в исследуемых группах. Важно отметить, что ни одна из групп не показала очень высоких значений среднего ТИМ (рис. 3).При этом наличие атеросклеротического поражения общей сонной артерии было равномерно распределено между группами; он был выявлен у 37,5% больных контрольной группы и у 35% группы ДРС, .

3.5. Профиль липидов плазмы и СРБ

Поскольку повышенный уровень триглицеридов в крови, уровень ЛПНП и общего холестерина, а также низкий уровень холестерина ЛПВП признан факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний; мы сравнили их концентрации в образцах крови, взятых у пациентов с оральной грибковой инфекцией и со здоровой слизистой оболочкой полости рта.Мы обнаружили, что уровни общего холестерина, холестерина ЛПНП и ЛПВП в плазме были одинаковыми в обеих группах; однако уровни триглицеридов были значительно повышены в группе DRS (рис. 4(а)). Удивительно, но уровни СРБ были одинаковыми в исследуемых группах, что указывает на отсутствие значимого компонента системного воспаления при DRS (рис. 4(b)). Поскольку уровень триглицеридов различался между группами и этот параметр мог влиять на сосудистую функцию, мы проверили, существует ли корреляция между ящуром или НМД и уровнями триглицеридов.Мы обнаружили, что эти параметры не коррелировали в случае Ящура (Спирмена = -0,13,) и NMD (Спирмена = -0,025,) (рис. 5).

3.6. Анализ подгрупп только среди женщин

Поскольку доля мужчин в нашей исследуемой популяции была намного ниже, мы провели дополнительный анализ подгрупп среди женщин. Выявлено, что все изученные сосудистые явления наблюдались в той же степени, что и в общей исследованной популяции, включая разницу в эндотелиальных вазорелаксациях (FMD (среднее ± SD): % у пациенток с DRS и % в контрольной группе; ) и уровни ТГ ( медиана [Q1; Q2]: 1,61 ± 1,46; 1,99 в DRS против 1,09 ± 0,86; 1,34 в не-DRS; ).

4. Обсуждение

Влияние гигиены полости рта на общее состояние здоровья очевидно. Инфекции и воспаления полости рта связаны со многими заболеваниями, такими как ревматоидный артрит [29], ожирение [30], негативные исходы беременности [31], сахарный диабет [32] и даже эпилепсия [33]. В частности, четко определена роль воспаления и инфекции полости рта в модулировании риска сердечно-сосудистых заболеваний [1–5]. Однако эти исследования были сосредоточены главным образом на воспалении пародонта и кровоточивости десен.В настоящем исследовании мы исследовали взаимосвязь между стоматитом, связанным с зубными протезами, распространенным воспалительным заболеванием полости рта у пожилых пациентов с эндотелиальной дисфункцией, артериальным давлением и профилем липидов. Мы наблюдали, что стоматит, связанный с зубными протезами, который возникает прибл. 60% пациентов, носящих зубные протезы, связаны со значительным снижением эндотелиальной функции, измеряемой как биодоступность оксида азота в клиническом исследовании дилатации, опосредованной потоком. Важно отметить, что в контроле индуцированная нитроглицерином эндотелийнезависимая вазодилатация не изменилась.Поскольку известно, что тяжесть эндотелиальной дисфункции коррелирует с развитием ИБС и предсказывает будущие сердечно-сосудистые события [34], наши результаты показывают, что наличие ДРС может быть связано с негативными сердечно-сосудистыми исходами. Таким образом, такие пациенты должны находиться под особенно тщательным наблюдением в отношении их сердечно-сосудистого риска. Учитывая, что DRS является одним из наиболее распространенных заболеваний полости рта у пожилых людей, встречающимся у 40–70% пациентов, носящих зубные протезы [9, 10], наше открытие может иметь важные последствия для клинической помощи пациентам, носящим зубные протезы.Однако важно отметить, что большинство обследованных здесь пациентов были женщинами, что согласуется с эпидемиологией DRS, то есть чаще встречается у женщин [9]. Мы также провели дополнительный анализ только женской субпопуляции, который подтвердил все основные наблюдения этого исследования.

Хотя многочисленные предыдущие исследования показали повышенный сердечно-сосудистый риск у субъектов с воспалительными заболеваниями полости рта, такими как пародонтит [1–5], эндодонтические инфекции [22–26] и даже кариес [19–21], это первое исследование, посвященное Сосудистая дисфункция у пациентов пожилого возраста, носящих зубные протезы.Это важно, поскольку в предыдущих исследованиях основное внимание уделялось бактериально-опосредованным заболеваниям, возникающим в результате нарушений физиологической микрофлоры полости рта, мы в первую очередь изучали грибковую инфекцию, поскольку ДРС чаще всего ассоциируется с инфекцией Candida .

Предыдущие исследования были сосредоточены на положительной связи между пародонтитом и дисфункцией эндотелия сосудов. Амар и др. и Блюм и др. наблюдали, что у субъектов с прогрессирующим заболеванием пародонта функция эндотелия хуже, чем у здоровых людей [35, 36].Блюм и др. [36], наряду с другими [6, 37], сообщили об улучшении функции эндотелия как о долгосрочном результате пародонтологического лечения. Тонетти и др. [6] в знаменательном исследовании показали в надлежащем рандомизированном контролируемом исследовании, что такое улучшение обеспечивает клиническую пользу на срок до 6 месяцев после интенсивного лечения.

Механизмы повышенного сердечно-сосудистого риска при воспалительных заболеваниях полости рта являются многофакторными и варьируются от хронического системного воспаления (пародонтита) до воздействия факторов риска, таких как диабет, гиперлипидемия, курение и возраст, которые предрасполагают как к сердечно-сосудистым заболеваниям, так и к заболеваниям полости рта, таким как как пародонтит [1–5], кариес [19–21], эндодонтические инфекции [22–26] или ДРС [9, 12, 13].Это совпадение факторов риска видно в изученной нами популяции больных. Хотя разница в распространенности курения или диабета не достигла статистической значимости, мы можем ясно видеть увеличение встречаемости этих факторов при ДРС. Это может частично объяснить повышенную степень эндотелиальной дисфункции у субъектов DRS. Измерение исходного уровня ящура до развития DRS в долгосрочном последующем исследовании, несомненно, укрепило бы выводы этого исследования. В качестве альтернативы, будущее интервенционное исследование, в котором влияние лечения DRS на функцию эндотелия также могло бы помочь решить эту проблему более причинно-следственным образом.Важно отметить, что поскольку популяция, которую мы изучали, была относительно молодой для носителей зубных протезов, значительного увеличения толщины интима-медиа еще не было обнаружено. Это согласуется с многочисленными сердечно-сосудистыми исследованиями, которые показывают, что эндотелиальная дисфункция предшествует развитию тяжелого атеросклероза [38].

Роль системного воспаления, очень хорошо определенная при пародонтите, при DRS неизвестна. Механизмы, посредством которых DRS может влиять на эндотелиальную дисфункцию, неясны. При пародонтите бактерии приводят к активации местного иммунного ответа, что приводит к системному воспалению.Точно так же сообщалось об иммунной стимуляции Т-клеток и моноцитов в ответ на грибковые антигены C. albicans [39, 40]. Однако в нашем исследовании мы не обнаружили значительного повышения уровня общего СРБ, что может свидетельствовать о том, что локальное воспаление слизистой оболочки полости рта, вызванное Candida , не вызывает значительной активации системного воспалительного ответа. Уровни СРБ среди беззубых оценивали Ajwani et al. в Helsinki Aging Study с участием более 600 пациентов старше 75 лет [41].Они идентифицировали поражения слизистой оболочки у беззубых как важный фактор, связанный с повышенным уровнем СРБ у пожилых людей, и отметили, что это значительно чаще встречается у беззубых с полными съемными протезами. Важно отметить, что у пациентов с клиническими признаками кандидоза ротовой полости или зубного стоматита также наблюдались повышенные уровни СРБ, и авторы предположили, что это может быть объяснением повышенных уровней СРБ, наблюдаемых у беззубых. В нашем исследовании мы также наблюдали тенденцию к более высоким значениям СРБ у пациентов с СРБ, но она не достигла статистической значимости, вероятно, из-за небольшого числа вовлеченных пациентов и того факта, что мы не измеряли высокочувствительный вчСРБ, который лучше характеризовал бы сердечно-сосудистые заболевания. риск [42].В свете наших результатов оценка других маркеров системного воспаления становится очень интересным аспектом для дальнейших исследований. Принимая во внимание наши результаты, в настоящее время наши данные не подтверждают гипотезу о вовлечении системного воспаления. Скорее всего, влияние сопутствующих факторов риска на DRS и сосудистую функцию наиболее вероятно.

Де Оливейра и др. и Rodriguez-Archilla et al. обнаружили, что пероральная инфекция Candida может влиять на состояние мононуклеарных клеток периферической крови, измеряемое количеством цитокинов, продуцируемых in vitro в ответ на антигены Candida [39, 40].Прямое воздействие клеток Candida на сосудистую систему маловероятно, так как системные микозы характеризуются, в отличие от ДРС, крайне тяжелой симптоматикой; более того, грибковая ДНК не была обнаружена в атеросклеротических поражениях [43].

Однако наши результаты могут указать нам на потенциальную роль сосудистых факторов риска, таких как диабет, курение и гипертриглицеридемия, в опосредовании сосудистой дисфункции. Хотя при простом корреляционном анализе связи между уровнями триглицеридов и эндотелиальной дисфункцией не было обнаружено, когда была введена многомерная линейная регрессия, включающая диабет, курение и/или уровни триглицеридов, разница в функции эндотелия перестала быть значимой (данные не показаны).Однако следует иметь в виду, что статистическая мощность такого анализа в исследуемой группе была относительно скромной.

Хотя вывод о том, что классические факторы риска могут быть основными медиаторами эндотелиальной дисфункции, может показаться не очень интересным, очень важно показать, что это имеет место у пациентов с ДРС, и поэтому эту группу пациентов следует тщательно изучить в более крупных эпидемиологических исследованиях. испытания. Это особенно важно в свете старения населения.

Несмотря на отсутствие различий в уровнях общего холестерина, холестерина ЛПВП и ЛПНП в крови здоровых лиц и больных с ДРС, мы наблюдали достоверно более высокие уровни триглицеридов у больных с ДРС.Наш неожиданный вывод о том, что DRS связан с избирательным повышением уровня триглицеридов, весьма интригующий и может быть связан с тем фактом, что ношение зубных протезов может изменить пищевые привычки. Это также может свидетельствовать о том, что повышенный уровень триглицеридов может быть фактором риска DRS, хотя наше исследование не могло ответить на этот вопрос. Нет исследований, посвященных параметрам липидов при DRS, в то время как в отношении периодонтита имеются противоречивые данные. Сэнди и др. и Пенумарти и др. наблюдали более высокие концентрации общего холестерина и холестерина ЛПНП в крови больных пародонтозом, чем в группе здоровых, но различия в уровнях триглицеридов и холестерина ЛПВП были показаны только Penumarthy et al., несмотря на меньшие размеры выборки [44, 45]. Одновременно Элтер и соавт. не продемонстрировали изменений уровней общего холестерина и ЛПВП после лечения пародонтита [37]. В целом эти результаты могут указывать на потенциальную связь между оральной инфекцией и профилем липидов в крови, но убедительные доказательства все еще необходимы.

Тенденции к повышению АД у больных с ДРС по сравнению со здоровыми людьми не наблюдалось. Это показывает потенциальную важную разницу в воспалительных состояниях полости рта, поскольку пародонтит потенциально связан с повышенным кровяным давлением, что часто наблюдалось [46].Взаимосвязь между использованием зубных протезов и распространенностью сердечно-сосудистых заболеваний, включая повышенное артериальное давление, обсуждалась Buhlin et al. [2]. Они обнаружили положительную связь между зубными протезами и всеми сердечно-сосудистыми заболеваниями, но не с повышенным кровяным давлением, инфарктом миокарда или инсультом. Однако группа, определяемая как «зубные протезы», была очень неоднородной. Авторы собрали вместе беззубых и частично беззубых носителей зубных протезов и беззубых без зубных протезов.Это создает потенциальную погрешность в отношении наличия пародонтита у пациентов с частичной адентией. Важно отметить, что в нашем исследовании практически все пациенты были полностью лишены зубов (41 из 44).

5.
Выводы

Таким образом, наше исследование показало, что пациенты с протезным стоматитом характеризуются более выраженной системной эндотелиальной дисфункцией, чем протезированные пациенты без стоматита. Это различие в сосудистой функции, вероятно, связано с повышенным сердечно-сосудистым риском при DRS и указывает на необходимость тщательного наблюдения за такими пациентами на предмет сердечно-сосудистых заболеваний.Хотя наше исследование выявило некоторые очень интересные и потенциально очень важные сердечно-сосудистые аспекты стоматита, связанного с зубными протезами, для окончательного подтверждения этих наблюдений требуется более крупное исследование. Это может быть очень важно для клинической практики, учитывая старение населения.

Сокращения
холестерина липопротеинов
ГОС: С-реактивный белок
DM: Сахарный диабет
СРД: Протез связанных стоматита
ящур: Поток-опосредованной дилатации
ЛВП: высокой плотности
ЛПНП: липопротеинов низкой плотности холестерина
НМД: Нитроглицерина-опосредованная дилатация
В 1 и В 3: 25-й ( Q 1) и 75-й ( Q 3) процентили
SD: S стандартное отклонение.
Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.

Вклад авторов

Joanna Maciąg и Grzegorz Osmenda внесли равный вклад в данное исследование.

Благодарности

Это исследование было поддержано Государственным фондом науки Республики Польша Грант №. 2997/B/P01/2009/36 и приветственный грант Фонда польской науки (FNP/Welcome/02) (TJG, TM, GO, AS).

Различные эффекты ингибирования протеасом на репликацию вируса везикулярного стоматита и полиовируса

Abstract

Активность протеасом является важной частью репликации вируса. В этом исследовании мы изучили влияние ингибиторов протеасом на репликацию вируса везикулярного стоматита (VSV) и полиовируса. Мы обнаружили, что ингибиторы протеасом значительно подавляли синтез белка ВВС, накопление вируса и защищали инфицированные клетки от токсического действия репликации ВВС.Напротив, репликация полиовируса задерживалась, но не уменьшалась в присутствии ингибиторов протеасом MG132 и бортезомиба. Мы также обнаружили, что ингибирование протеасом стимулирует связанные со стрессом процессы, такие как накопление шаперона hsp70, фосфорилирование eIF2α и общее ингибирование трансляции. Репликация VSV была чувствительна к этому стрессу со значительным снижением процесса репликации. Рост полиовируса был менее чувствительным, только с задержкой репликации. Ингибирование протеасомной активности подавляло синтез клеточного белка и белка ВВС, но не уменьшало синтез белка полиовируса.Протеинкиназа GCN2 поддерживает способность ингибиторов протеасом ослаблять общую трансляцию и подавлять репликацию VSV. Мы предполагаем, что разные механизмы инициации трансляции ВВС и полиовируса определяют их чувствительность к стрессу, вызванному ингибированием протеасом. Насколько нам известно, это первое исследование, которое связывает эффект стресса, вызванного ингибированием протеасом, с эффективностью вирусной инфекции.

Образец цитирования: Незнанов Н., Драгунский Э.М., Чумаков К.М., Незнанова Л., Век Р.С., Гудков А.В., и др.(2008) Различный эффект ингибирования протеасом на репликацию вируса везикулярного стоматита и полиовируса. ПЛОС ОДИН 3(4): е1887. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887

Редактор: Оливье Шварц, Институт Пастера, Франция

Получено: 3 декабря 2007 г.; Принято: 26 февраля 2008 г .; Опубликовано: 2 апреля 2008 г.

Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями декларации Creative Commons Public Domain, которая предусматривает, что после помещения в общественное достояние эта работа может свободно воспроизводиться, распространяться, передаваться, изменены, построены или иным образом использованы кем-либо в любых законных целях.

Финансирование: Работа выполнена при поддержке гранта NIH Амии К. Банерджи (AI26585), грантов NIH Андрею В. Гудкову (CA60730 и CA88071) и средств, предоставленных Исследовательским институтом Лернера Николаю Незнанову .

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Протеасомы представляют собой клеточные структуры, отвечающие за быстрый, эффективный и строго регулируемый процесс деградации белков [1].Субстраты деградации сначала подвергаются полиубиквитинированию, а затем перевариваются протеасомами [2]. Убиквитин/протеасомный путь является основным путем регулируемой деградации белка в эукариотических клетках [1]. Помимо специальных мишеней для убиквитинирования и протеасом-специфической деградации, таких как p53, IκBα, STAT [3]–[6], протеасомы ответственны за деградацию развернутых или неправильно свернутых белков [7], [8]. В сочетании с шаперонами эта активность протеасом важна для поддержания гомеостаза клеточных белков [9], [10].

Специфическая протеасомная деградация является важной частью репликации нескольких вирусов [11], [12]. Некоторые вирусы разработали механизмы нацеливания на клеточные белки, такие как p53 и STAT, для протеасом-специфической деградации [13], [14]. Стабильность некоторых вирусных белков, в том числе полиовируса и белка 3С ВГА, также зависит от активности протеасом [15]. В настоящей работе мы изучили роль протеасом в репликации вируса везикулярного стоматита (ВВС) и полиовируса.

VSV относится к Rhabdoviridae [16].Рабдовирусы имеют геномы РНК с отрицательной цепью, и их репликация начинается с синтеза мРНК с положительной цепью вирусной РНК-полимеразой [17]. Подобно клеточным мРНК, мРНК VSV кэпированы и полиаденилированы [18], [19]. Реплицирующийся вирус эффективно конкурирует с клеточными процессами за субстраты для синтеза РНК и белков, а также за аппарат трансляции [20]–[23]. В результате вирусные белки составляют значительную долю вновь синтезируемых белков в инфицированных клетках.

Полиовирус

относится к роду энтеровирусов Picornaviridae [24].Пикорнавирусы имеют геномы РНК с положительной цепью, которые могут транслироваться сразу после заражения [25]. В отличие от ВВС и большинства клеточных мРНК инициация трансляции пикорнавируса происходит во внутреннем сайте посадки рибосомы (IRES) [26]. Репликация полиовируса запускает расщепление eIF4G, необходимого для кэп-зависимой инициации, что приводит к подавлению синтеза клеточных белков и быстрому накоплению вирусных белков и РНК [27], [28].

Убиквитинирование оказывает широкое воздействие на вирусные инфекции.Например, способность убиквитинирования регулировать эндоцитоз и эндосомальный мембранный транспорт [29] может способствовать созреванию и почкованию ретровирусов [30], [31] и парамиксовирусов [32], включая рабдовирусы, такие как ВВС и вирус бешенства [32]. ], [33]. Ранее постулировалась роль свободного убиквитина и протеасом на поздней стадии репликации ВВС, включая почкование [33].

В отличие от эффектов активности протеасом/убиквитина на созревание и почкование VSV [33], мы обнаружили новый эффект ингибирования протеасом на синтез белка VSV и накопление вируса.Этот эффект проявляется на ранних стадиях репликации VSV. Ингибирование протеасом оказывало пагубное влияние на ВВС и синтез клеточных белков в инфицированных вирусом клетках и защищало клетки от токсического действия инфекции ВВС. Негативного влияния ингибиторов протеасом на репликацию ВВС и синтез клеточных белков в клетках GCN2-/- не обнаружено. Напротив, репликация полиовируса была менее чувствительна к действию ингибиторов протеасом. Ингибирование протеасомной активности задерживает все процессы репликации полиовируса, но не отменяет их, не изменяет накопление вируса и его токсическое действие.Мы предполагаем, что стресс, вызванный накоплением аберрантных продуктов трансляции после ингибирования протеасом, приводит к подавлению кэп-зависимой трансляции, что объясняет, почему ингибиторы протеасом блокируют репликацию VSV, но не полиовируса.

Результаты

Ингибирование протеасомной активности подавляет репликацию ВВС и защищает клетки от инфекции

Для изучения влияния ингибитора протеасом на репликацию VSV клетки HeLa обрабатывали различными количествами ингибитора протеасом MG132 (Calbiochem) и одновременно инфицировали VSV в течение ночи.Низкие концентрации ингибитора (от 1 до 10 мкМ) не оказывали видимого токсического действия на клетки после инкубации в течение ночи. В то время как заражение VSV при MOI = 1 приводило к полной гибели необработанных клеток HeLa в течение ночи, добавление MG132 в указанных концентрациях защищало клетки от токсического действия инфекции VSV. Снижение выхода вируса подтвердило, что MG132 подавлял репликацию VSV в клетках HeLa при концентрациях, начиная с 2,5 мкМ (рис. 1А). Для анализа синтеза белка VSV клетки HeLa инфицировали VSV при MOI = 5 в течение 4 ч и обрабатывали различными количествами MG132 во время заражения.Сниженные уровни белка VSV также наблюдались с помощью иммуноблоттинга (рис. 1В).

Рис. 1. Ингибитор протеасом MG132 подавляет репликацию ВВС и синтез белка.

(A) Титрование VSV в клетках, обработанных MG132. Клетки HeLa инфицировали ВВС (MOI = 1) в течение одного часа с дополнительной промывкой и инкубировали в течение ночи. Среду из контрольных клеток, инфицированных VSV, и клеток, инфицированных VSV, обработанных 10 мкМ, 5 мкМ, 2,5 мкМ и 1 мкМ MG132, использовали для анализа бляшек для обнаружения репликации вируса.Результаты представляют собой средние данные двух экспериментов. (B) Вестерн-блоттинг с антителами против P-белка. Клетки HeLa инфицировали VSV (MOI = 5) в течение 1 часа. После смены среды добавляли MG132 в указанных концентрациях и инкубировали клетки еще 4 часа. Экстракты общего белка (5 мкг) анализировали с антителами против Р-белка. Кератин 18 (К18) был контролем загрузки белка. Интенсивность каждой полосы оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ для расчета процента ингибирования синтеза вирусного белка.(C) Иммунопреципитация меченого S 35 P-белка. Клетки HeLa инфицировали VSV (MOI = 5) в течение 4 часов. Белки метили метионином/цистеином S 35 в течение последних 30 мин инфекции, Р-белок ВВС осаждали специфическими антителами из экстрактов цитоплазматических белков и анализировали с помощью электрофореза и авторадиографии. MG132 добавляли на 4 ч в указанных концентрациях. (D) Иммунопреципитация меченого S 35 N-белка. Белковые экстракты, описанные на панели С, осаждали антителами, специфичными к N-белку.Белки анализировали электрофорезом и авторадиографией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g001

Дополнительные эксперименты были проведены с использованием иммунопреципитации белков, меченных метионином/цистеином S 35 , из клеток, инфицированных VSV. Клетки HeLa инфицировали VSV при MOI = 5 в течение 4 ч и обрабатывали различным количеством MG132 во время заражения. Вновь синтезированные белки метили S 35 -метионином и цистеином и готовили белковые экстракты цитоплазмы по протоколу Дингмана [34].Затем из цитоплазматических экстрактов с использованием соответствующих антител осаждали белки ВВС P и N. Эффективность синтеза белков вируса оценивали с помощью электрофореза и авторадиографии (рис. 1, В, Г). Во всех экспериментах наблюдалось значительное зависящее от концентрации подавление репликации вируса и синтеза вирусного белка с помощью 5 и 10 мкМ MG132.

Анализ ингибирующей активности MG132 во времени

В наших первоначальных экспериментах мы обрабатывали инфицированные VSV клетки MG132 в начале инфекции.В следующем эксперименте клетки HeLa обрабатывали 5 мкМ MG132 во время заражения, через один, два и три часа после заражения VSV, чтобы проанализировать связь между действием протеасомного ингибитора и интернализацией вируса. Эффективность репликации вируса после ночного заражения ВВС при множественности заражения  = 1 (рис. 2А, В) или через 4 ч при множественности поражения  = 5 (рис. 2Б,Г) оценивали методом бляшечного анализа (рис. 2А), Нозерн (рис. 2В), с помощью вестерн-блоттинга 5 мкг общего белка с антителами против Р-белка (рис.2В), так и иммунопреципитацией меченого S 35 Р-белка (рис. 2Г). Хотя ингибирующий эффект MG132 на репликацию VSV был самым сильным, когда лекарство добавляли раньше, значительное ингибирование репликации VSV все еще обнаруживалось, когда MG132 добавляли через 3 часа после заражения VSV.

Рисунок 2. Влияние MG132 на репликацию VSV в разное время заражения.

(A) Титрование вируса VSV из среды инфицированных в течение ночи клеток HeLa. Клетки HeLa инфицировали вирусом VSV MOI = 1.Инкубация клеток с вирусом продолжалась один час с дополнительным отмыванием. 5 мкМ MG132 добавляли к клеткам во время заражения (15 ч), через 1 ч (14 ч), через 2 ч (13 ч) и через 3 ч (12 ч) после заражения ВВС. Результаты представляют собой средние данные двух экспериментов. (B) Синтез мРНК VSV в клетках, обработанных MG132. Нозерн-блоттинг 10 мкг тотальной РНК ВВС (MOI = 5), инфицированных в течение 4 ч клеток, обработанных MG132, во время заражения (4 ч) или через 1 ч после инфицирования (3 ч). Гибридизация с меченым P 32 зондом кДНК P-белка.Нагрузку РНК стандартизировали путем гибридизации с зондом гена GAPDH. Сигнал гибридизации каждой полосы оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ для расчета процента ингибирования синтеза РНК. (C) Иммуноблоттинг с антителами против P-белка. Клетки HeLa инфицировали VSV (MOI = 1) и обрабатывали 5 мкМ MG132, как показано на панели A. Экстракты общего белка (5 мкг) из этих клеток очищали и тестировали вестерн-блоттингом с анти-P-белковыми антителами. Кератин 18 был контролем загрузки белка. (D) Иммунопреципитация S 35 -меченого метионином P-белка из клеток, инфицированных VSV.Клетки HeLa инфицировали VSV (MOI = 5) и обрабатывали 5 мкМ MG132 во время заражения (4 часа), через 1 час после заражения (3 часа) или через 2 часа после заражения (2 часа). Через 4 ч после заражения клетки инкубировали с S 35 -метионином/цистеином в течение 30 мин. Экстракты цитоплазматического белка очищали и Р-белок VSV осаждали анти-Р-белковыми антителами. Эффективность синтеза Р-белка оценивали с помощью электрофореза и авторадиографии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g002

Пагубное влияние ингибирования протеасом на репликацию ВВС не зависит от типа ингибитора

Чтобы подтвердить, что ингибирующий эффект MG132 обусловлен его подавлением активности протеасом, мы протестировали различные ингибиторы протеасом. Ингибитор протеасом 1 представляет собой модифицированный трипептид со структурой, отличной от MG132. Его протеасомоингибирующая активность требует более высоких концентраций, чем MG132. В этих экспериментах MG132 служил положительным контролем.Оба ингибитора протеасом влияли на репликацию VSV в клетках HeLa сходным образом (рис. 3, панели A и B). Бортезомиб (PS341) — специфический ингибитор протеасом, одобренный FDA в качестве противоракового препарата [35]. Его структура и механизм действия отличаются от MG132 и протеасомного ингибитора 1. Он более активен, чем MG132, и его использовали в таких низких концентрациях, как 100 нМ. Бортезомиб, как и другие ингибиторы протеасом, подавлял репликацию VSV (рис. 3, панели A и C).

Рис. 3.Различные ингибиторы протеасом влияют на репликацию VSV.

(A) Ингибитор протеасом 1 и бортезомиб снижали репликацию VSV. Титрование ВВС из среды ночных инфицированных клеток HeLa. Заражение ВВС (MOI = 1) в течение одного часа заменяли на обычную среду с указанной концентрацией ингибиторов протеасом. VSV титровали анализом бляшек после роста в течение ночи. (Б) Анализ синтеза Р-белка в клетках, обработанных ингибитором протеасом 1. Клетки HeLa инфицировали VSV (MOI = 5) в течение 4 ч и обрабатывали ингибитором протеасом 1 (PI) или MG132 (MG) во время Инфицирование ВВС.Экстракты общего белка (5 мкг) из этих клеток анализировали вестерн-блоттингом с анти-P-белковыми антителами. Концентрации ингибиторов протеасом варьировали от 5 до 20 мкМ. Кератин 18 (К18) был контролем загрузки белка. (C) Бортезомиб подавлял репликацию VSV. Клетки HeLa инфицировали VSV, обрабатывали бортезомибом (100 нМ) и MG132 (5 мкМ) и анализировали, как описано на панели B. K18 представлял собой контроль загрузки белка.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g003

Ингибиторы протеасом задерживают синтез полиовирусных белков, РНК и накопление живого вируса

Чтобы понять возможную роль протеасом в репликации полиовируса, мы изучили кинетику вирусной инфекции путем титрования инфекционного вируса, высвобождаемого в среду инфицированных полиовирусом клеток HeLa с двухчасовой предварительной обработкой MG132 и без нее. Хотя титры вируса на поздних фазах вирусной инфекции (5–6 ч) были одинаковыми в контрольных клетках и в клетках, предварительно обработанных MG132, накопление вируса заметно задерживалось между 3 и 4 ч в клетках, в которых протеасомная активность подавлялась MG132. (Рисунок.4А). Эффективность ингибитора протеасом была подтверждена стабилизацией IκBα в клетках HeLa, обработанных TNF (рис. 4B) [36]. В качестве независимого подтверждения изменения кинетики накопления полиовируса в клетках, предварительно обработанных ингибитором протеасом, мы обнаружили, что появление и накопление капсидных белков полиовируса также задерживалось в клетках, предварительно обработанных MG132 (рис. 4В). Таким же образом появление вирусных неструктурных белков 3C и 3A/3AB также задерживалось на один час в обработанных MG132 клетках, инфицированных полиовирусом (фиг.4Д). Бортезомиб оказывал аналогичный эффект на репликацию полиовируса (рис. 4Е). В соответствии с данными иммуноблоттинга, по оценке Нозерн-блоттинга, наблюдалась задержка накопления вирусной геномной РНК в клетках, предварительно обработанных MG132 (фиг. 5А).

Рисунок 4. Ингибиторы протеасом задерживают репликацию полиовируса.

(A) Клетки HeLa (треугольники) и клетки HeLa, предварительно обработанные в течение 2 ч 5 мкМ ингибитора протеасом MG132 (квадраты), инфицировали штаммом полиовируса Mahoney (MOI = 5) в течение 1 ч.После замены среды накопление вируса в среде оценивали титрованием. (B) MG132 ингибирует TNF-специфическую деградацию IκBα. Контрольные клетки HeLa и клетки HeLa, предварительно обработанные 5 мкМ MG132 в течение 2 ч, инкубировали с 1 нг/мл человеческого TNF в течение 20 мин. 10 мкг экстрактов общего белка анализировали с помощью антител против IκBα. (C) Клетки HeLa и клетки HeLa, предварительно обработанные MG132, были инфицированы полиовирусом (MOI = 5) в течение 1 часа. После замены среды белковые экстракты собирали в разное время заражения.Накопление капсидных белков полиовируса проверяли в экспериментах по Вестерн-блоттингу с использованием 10 мкг белковых экстрактов. (D) Белковые экстракты, описанные в разделе B, тестировали с антителами против белков 3C и 3A. Накопление полиовирусных белков 3С, 3А и 3АВ выявляли в 10 мкг белковых экстрактов. (E) Лечение бортезомибом ослабляло репликацию полиовируса. Клетки HeLa предварительно обрабатывали бортезомибом в течение 2 часов, затем инфицировали и анализировали, как описано на панелях C и D. K18 служил контролем загрузки.Hsp70 является контролем активности бортезомиба.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g004

Рисунок 5. (A) Накопление РНК полиовируса было задержано, но не отменено в обработанных MG132 клетках, инфицированных полиовирусом.

Нозерн-блот-гибридизация 5 мкг тотальной РНК из клеток, инфицированных полиовирусом, с гибридизационной пробой белка полиовируса 3C. Гибридизация с геном GAPDH служила контролем загрузки РНК. (B) Ингибирование протеасомной активности не влияет на проникновение полиовируса в клетки.Обработанные MG и контрольные клетки HeLa предварительно инкубировали с полиовирусом, меченным S 35 (MOI = 100), в течение 1 ч при 4°C. Для оценки адсорбционного фона клетки (ad) промывали холодным PBS. Интернализацию вируса (в) оценивали по накоплению меченных S 35 капсидных белков полиовируса в течение дополнительного 1 ч инкубации при 37°С. Белки, меченные S 35 , анализировали электрофорезом и авторадиографией. (C) Капсидные белки полиовируса накапливаются медленнее в клетках, предварительно обработанных MG132.Экстракты клеток, инфицированных полиовирусом, анализировали с помощью капсидных антител против полиовируса. Контрольные клетки или клетки, предварительно обработанные MG132 через 2 часа, инкубировали с полиовирусом (MOI = 5) в течение 1 часа. Среду, содержащую вирус, отмывали и клетки инкубировали в течение указанного времени. 10 мкг белка из инфицированных клеток анализировали вестерн-блоттингом с антиполиовирусными капсидными антителами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g005

Ингибирование протеасомной активности не влияет на проникновение полиовируса в клетку

Задержка репликации полиовируса в клетках, обработанных MG132, может быть результатом менее эффективного проникновения полиовируса в клетки HeLa, обработанные MG132.Для изучения эффективности проникновения полиовируса в клетки HeLa мы проверили наличие капсидных белков полиовируса, меченных S 35 , в клетках HeLa после инкубации клеток HeLa с полиовирусом, меченным S 35 . В этом эксперименте клетки HeLa инкубировали с полиовирусом в течение одного часа при 4°С, вируссодержащую среду удаляли и клетки инкубировали еще в течение часа при 37°С. Белки из клеток анализировали на меченые S 35 капсидные белки вируса с помощью электрофореза и авторадиографии.Аналогичное количество капсидных белков инфицированного вируса можно было обнаружить в течение первого часа инфекции независимо от того, обрабатывали ли клетки протеасомным ингибитором (рис. 5В). Позже во время инфекции капсидные белки быстрее накапливались в контрольных клетках, чем в клетках, обработанных MG132 (рис. 5C)

Полиовирус-специфическое протеолитическое расщепление белков p65-RelA и eIF4G задерживается протеасомным ингибитором

Недавно мы описали способность полиовируса расщеплять субъединицу p65-RelA фактора транскрипции NFκB вблизи его С-конца [37].Это расщепление специфично для протеазы 3C и происходит между 2 и 3 часами инфекции в клетках HeLa. Подавление протеасомной активности задерживает 3C-специфическое расщепление протеазы p65-RelA примерно на 60 мин (фиг. 6А). Эти данные свидетельствуют о том, что ингибитор протеасом MG132 не останавливал процесс протеазного 3C-специфического расщепления p65-RelA в клетках, инфицированных полиовирусом. Кроме того, добавление MG132 к неинфицированным клеткам не приводило к заметному повышению уровня p65-RelA. Это позволяет предположить, что замедление деградации p65-RelA в инфицированных полиовирусом клетках, обработанных ингибитором протеасом, может быть объяснено задержкой синтеза вирусной протеазы 3C, которая опосредует эту деградацию.

Рис. 6. Протеолитическое расщепление p65-RelA и eIF4G происходило позже при заражении полиовирусом клеток с ингибированной протеасомной активностью. Клетки HeLa

и клетки HeLa MG 132, предварительно обработанные через 2 часа, инфицировали полиовирусом (MOI = 5) в течение 1 часа. После смены среды экстракты общего белка собирали каждый час и тестировали с антителами, специфичными к С-концу p65-RelA (A), или с антителами, специфичными к N-концу eIF4G (B). 10 мкг белка тестировали в экспериментах по Вестерн-блоттингу.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g006

Способность протеазы полиовируса расщеплять фактор инициации трансляции eIF4G является важным этапом репликативного цикла вируса [38], [39]. Этот механизм позволяет полиовирусу конкурировать с клеточными мРНК за механизм трансляции и ингибировать многие клеточные защитные реакции, требующие синтеза новых антивирусных белков. Процесс деградации eIF4G является одним из самых ранних событий полиовирусной инфекции, происходящим в течение первых 90 мин инфекции в клетках HeLa и зависящим от активности полиовирусной протеазы 2А.Обработка инфицированных полиовирусом клеток HeLa ингибитором протеасом замедляла расщепление белка p220 eIF4G (рис. 6В). Таким образом, ингибирование протеасом задерживает, но не отменяет вирусспецифического расщепления клеточных белков.

Ингибирование протеасом задерживает синтез полиовирусных белков

Накопление вирусного капсидного белка и некапсидных белков 3C, 3A и 3AB задерживалось в клетках, обработанных MG132 (рис. 4 C, D). Для более детального изучения процесса синтеза белка полиовируса клетки HeLa инфицировали полиовирусом в течение 2, 3 и 4 ч и добавляли S 35 метионин/цистеин на 30 мин в конце каждого периода.Капсидные белки выявляли иммунопреципитацией, электрофорезом и затем авторадиографией (рис. 7А, Б). Опять же, накопление синтезированных de novo капсидных белков задерживалось, но не устранялось в клетках, обработанных MG132.

Рисунок 7. Синтез белка полиовируса был задержан в клетках, предварительно обработанных MG132.

Контрольные клетки HeLa и клетки HeLa, предварительно обработанные MG132 в течение 2 часов, инфицировали полиовирусом (MOI = 5) в течение 2, 3 и 4 часов. Все клетки инкубировали в среде, не содержащей метионин/цистеин, с добавлением S 35 -метионин/цистеин в течение последних 30 мин перед сбором.Для изучения общей трансляции 10 мкг экстрактов цитоплазматических белков разделяли электрофорезом и анализировали авторадиографией (А). Для изучения накопления капсидного белка полиовируса капсидные белки осаждали специфическими антителами из 100 мкг экстрактов белков цитоплазмы и анализировали с помощью электрофореза и авторадиографии (В).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g007

В клетках, обработанных MG132, не было обнаружено дополнительного накопления предшественника капсидного белка P1, что указывает на то, что MG132 не подавлял активность протеаз полиовируса.

Влияние ингибирования активности протеасом на клеточную трансляцию

ВВС и полиовирусные инфекции подавляют трансляцию клеточных РНК [40]–[43]. Для анализа трансляционной активности в клетках, обработанных MG132 и инфицированных ВВС или полиовирусом, мы метили клеточные белки in vivo метионином/цистеином S 35 и иммунопреципитировали актин специфическими антителами (рис. 8 А, Б). Инфицирование клеток HeLa ВВС и полиовирусом снижало общий синтез клеточного белка (рис.8А, 7А). Обработка клеток HeLa MG132 подавляла синтез клеточного белка (фиг. 8А, 7А). Этот эффект был также подтвержден анализом синтеза актина в клетках, обработанных MG132 (рис. 8 Б, В). В отличие от синтеза клеточного белка, накопление капсидных белков полиовируса лишь немного задерживалось в клетках HeLa, предварительно обработанных MG132 (фиг. 7В).

Рисунок 8. Влияние MG132 и вирусной инфекции на синтез клеточного белка.

(A) Белковые экстракты очищали от контрольных клеток HeLa, клеток, инфицированных VSV в течение 4 часов, клеток, обработанных 5 мкМ MG132 в течение 4 часов, и клеток, инфицированных VSV и обработанных MG132 в течение 4 часов.Все клетки инкубировали с метионином/цистеином S 35 в течение последних 30 мин перед очисткой белковых экстрактов. Экстракты белков цитоплазмы анализировали с помощью электрофореза и авторадиографии. (B) Экстракты цитоплазматического белка из контрольных, инфицированных VSV и клеток, обработанных MG, осаждали антителами против актина, и комплексы очищали на агарозе с белком А. S 35 меченный актин анализировали электрофорезом и авторадиографией. (C) Цитоплазматические белковые экстракты, меченные S 35 , из обработанных MG и инфицированных полиовирусом клеток осаждали антителами против актина и анализировали, как описано на панели B.Интенсивность всех белковых полос определяли с помощью программного обеспечения ImageJ для расчета процента ингибирования синтеза белка.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g008

Ингибирование протеасомы стимулирует накопление шаперона hsp70 и фосфорилирование eIF2α

Ингибирование общей трансляции является частым следствием различных стрессовых стимулов [44], [45]. Фосфорилирование eIF2α и накопление молекул шаперонов являются дополнительными маркерами стрессового ответа [46].Мы проанализировали появление этих маркеров в клетках HeLa, обработанных MG132. S 35 экстракты цитоплазматических белков с импульсной меткой очищали и осаждали антителами против hsp70 для исследования с помощью электрофореза и авторадиографии. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 9А. Вновь синтезированный белок массой 70 кДа, соответствующий hsp70, накапливался во всех клетках, обработанных MG132. Фосфорилирование eIF2α в обработанных MG132 клетках выявляли с помощью антител, специфичных к фосфорилированной форме eIF2α.Фосфорилирование eIF2α обнаружено в клетках, обработанных MG132, и в клетках, обработанных другим стресс-индуцирующим агентом, тапсигаргином (ингибитором саркоэндоплазматического ретикулума Са +2 АТФазы), но не обнаружено в контрольных клетках HeLa (рис. 9Б). ). Таким образом, ингибирование протеасом стимулировало появление маркеров стресса, таких как ингибирование общей трансляции, фосфорилирование eIF2α и накопление шаперона hsp70.

Рисунок 9. Лечение MG132 активирует стресс.

(A) Ингибирование синтеза hsp70, активированного протеасомой. Контрольные клетки HeLa, клетки, обработанные в течение 4 ч MG132, и 4 ч инфицированные VSV клетки инкубировали в течение последних 30 мин с S 35 метионином/цистеином. Цитоплазматические белки осаждали антителами против hsp70 и против P-VSV. Осажденные белки анализировали электрофорезом и авторадиографией. (B) MG132 стимулировал фосфорилирование eIF2α. Клетки HeLa обрабатывали 1 мкМ тапсигаргина в течение 1 часа и 5 мкМ MG132 в течение 4 часов.10 мкг белковых экстрактов анализировали с помощью антител, специфичных к eIF2α и eIF2α-фосфату (eIF2α-P). Hsp70 является маркером стресса, активированного MG132. Кератин 18 (К18) – контроль нагрузки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g009

Активность GCN2 важна для вредного воздействия ингибитора протеасом на репликацию VSV

GCN2 — протеинкиназа, ответственная за фосфорилирование eIF2α в ответ на аминокислотное голодание и некоторые другие стрессы [44], [47].Стресс, индуцированный ингибиторами протеасом, и ослабленная трансляция зависят от GCN2 [44], [47]. Чтобы доказать роль стресса, вызванного ингибированием протеасом, в подавлении репликации VSV, мы использовали GCN2+/+ MEF дикого типа (wt) и GCN2-/- MEF для инфекции VSV. Ингибирование протеасомной активности ослабляло общую трансляцию в GCN2+/+ MEF дикого типа, но не влияло на синтез белка в клетках GCN2-/- (фиг. 10А). MG132-специфическое фосфорилирование фактора eIF2α было менее эффективным в клетках GCN2-/-, чем в клетках GCN2+/+ MEF дикого типа (рис.10В). В соответствии с этими данными на репликацию VSV влияли ингибиторы протеасом в GCN2+/+ MEF дикого типа, но не изменяли в клетках GCN2-/- (фиг. 10 C, D). Удивительно, но активность GCN2 подавляла репликацию VSV в MEF без дополнительной обработки ингибиторами протеасом (рис. 10 C, D).

Рисунок 10. Ингибирование репликации VSV в фибробластах, обработанных MG132, зависит от GCN2.

(A) Ослабление трансляции в клетках, обработанных MG132- (MG) и бортезомибом (Bort), зависит от GCN2.Контрольные клетки дикого типа GCN2+/+ MEF и GCN2-/- MEF или клетки, обработанные ингибиторами протеасом в течение 4 ч, инкубировали с S 35 -метионином/цистеином в течение 30 мин. Синтез белка оценивали с помощью электрофореза и авторадиографии. (B) Вестерн-иммуноблоттинг-анализ GCN2-зависимого фосфорилирования eIF2α в ответ на MG132. 10 мкг белковых экстрактов из контрольных клеток и клеток, обработанных MG132, анализировали с указанными антителами. Коэффициент эффективности фосфорилирования eIF2α (Phosp(x)) оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ.(C, D) На репликацию VSV не влияли ингибиторы протеасом в GCN2-/- MEF. Ингибиторы протеасом добавляли через 1 ч после инфицирования VSV (MOI = 1) и клетки инкубировали в течение ночи. Репликация VSV оценивалась титрованием в двух экспериментах (C) или вестерн-иммуноблоттингом с антителами к белку P-VSV (D). Тубулин (ванночка) является регулятором белковой нагрузки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g010

Фосфорилирование eIF2α при ВВС и полиовирусной инфекции

Вирусная инфекция часто связана со стрессорными клеточными процессами, включая индукцию PKR-специфического фосфорилирования eIF2α двухцепочечными вирусными РНК [44], [48].Мы проанализировали способность полиовируса и ВВС активировать фосфорилирование eIF2α через 4 ч после заражения (рис. 11). Полиовирусная инфекция стимулировала фосфорилирование фактора инициации трансляции через 4 ч после заражения. Напротив, инфекция VSV не индуцировала фосфорилирования eIF2α в это время заражения. Наши данные совпадают с более ранними сообщениями [49], [50]. Согласно этим публикациям, фосфорилирование eIF2α может быть обнаружено в клетках, инфицированных полиовирусом, начиная с 3 ч после заражения, но в клетках, инфицированных ВВС, фосфорилирование eIF2α было обнаружено только через 8 ч после заражения [49], [50].Таким образом, существует корреляция между способностью вирусной инфекции стимулировать фосфорилирование eIF2α и ее устойчивостью к этому фосфорилированию, стимулируемому другими стимулами, такими как ингибиторы протеасом.

Рисунок 11. Различная активация фосфорилирования eIF2α вирусом VSV и полиовирусной инфекцией.

Клетки HeLa инфицировали VSV в течение 4 часов, инфицировали полиовирусом в течение 4 часов или обрабатывали 1 мкМ тапсигаргина в течение 1 часа. Экстракты цитоплазматического белка из этих и контрольных клеток анализировали с помощью антител против eIF2α и фосфорилированной формы eIF2α (панель А).Та же самая мембрана была проанализирована с использованием антител против P-белка VSV и капсидных белков полиовируса (панель B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001887.g011

Обсуждение

Убиквитинирование играет важную роль в почковании ретровирусов и парамиксовирусов, таких как вирус Сендай, ВВС и вирус бешенства [30], [32], [33]. Репликация вирусов Коксаки чувствительна к ингибитору протеасом [51]. На поздних стадиях репликации парамиксовируса происходит снижение накопления инфекционного вируса в культуральной среде, но не изменяется эффективность синтеза вирусного белка при высоких концентрациях MG132 (до 100 мкМ) [32], [33].В этой работе мы описываем новые эффекты ингибиторов протеасом на репликацию ВВС и полиовируса и демонстрируем, что эти вирусы по-разному реагируют на ингибирование. Мы представляем данные, свидетельствующие о том, что ингибирование протеасом 5 мкМ MG132, 10 мкМ протеасомного ингибитора 1 и 100 нМ бортезомиба на ранних стадиях инфекции ВВС подавляло накопление вируса более чем в 100 раз и влияло на синтез белков ВВС P и N. Ингибирование протеасом снижало эффективность репликации VSV при введении во время заражения, а также после него, указывая на то, что эффект MG132 на репликацию VSV не зависит от проникновения VSV в клетки.Обработка MG132 клеток, инфицированных вирусом VSV, незначительно снижала эффективность синтеза мРНК VSV, что может быть следствием менее эффективного синтеза РНК-полимеразы L VSV. Это снижение количества РНК приводит к дальнейшему снижению количества вирусных белков.

В отличие от ВВС, ингибирование протеасом в клетках HeLa задерживает все процессы при репликации полиовируса на 60–90 мин, но не устраняет накопление полиовируса. Наши данные контрастируют с эффектом ингибиторов протеасом на репликацию вируса Коксаки в кардиомиоцитах, опубликованным Luo H.[51]. Авторы анализировали накопление вируса и синтез белков и РНК через 7 ч после заражения, но не анализировали кинетику репликации вируса Коксаки. Одно из объяснений заключается в том, что ингибиторы протеасом могут также задерживать репликацию вируса Коксаки в кардиомиоцитах, поскольку 7 часов репликации вируса Коксаки могут соответствовать 3 часам репликации полиовируса в клетках HeLa. Чтобы увидеть эффект, потребуется более длительный период наблюдения. Альтернативным объяснением может быть использование разных клеточных линий для роста вируса.Кардиомиоциты могут иначе реагировать на ингибирование протеасом, чем клетки HeLa, что приводит к другому влиянию на эффективность репликации вируса.

Протеасомная специфическая деградация клеточных белков является важным механизмом регуляции многочисленных клеточных процессов, включая активацию и ингибирование специфически регулируемой транскрипции и передачи сигнала, апоптоза и клеточного цикла [52]. В этих процессах протеасомы являются важнейшими компонентами пути, обеспечивающего специфическую деградацию убиквитинированных субстратов.Некоторые вирусы способны нацеливать клеточные белки на протеасом-специфическую деградацию [1], [53].

Другая функция протеасом заключается в поддержании гомеостаза клеточных белков путем деградации неправильно свернутых, частично свернутых или несвернутых белков [54]. Значительная часть вновь синтезированных клеточных белков не может правильно свернуться в процессе синтеза. Эти развернутые белки называются продуктами дефектных рибосом [55]. В клетках есть две системы, решающие проблему неправильной укладки белков: молекулярные шапероны и убиквитин-протеасомная система [54].Обилие развернутых белков увеличивается в условиях, когда клетки синтезируют больше белков, например при вирусной инфекции. Избыток вновь синтезированных развернутых белков может привести к их агрегации друг с другом или другими белками. Трансляционная аттенуация является одним из ответов на этот стресс [56], [57] и опосредована фосфорилированием фактора инициации eIF2α [47], [56], что является общим механизмом регуляции синтеза белка [46], [ 48], [58]. Ингибирование трансляции в клетках, обработанных MG132, также зависело от фосфорилирования eIF2α [47].Репликация ВВС, а также синтез белков ВВС и большинства клеточных белков чувствительны к фосфорилированию eIF2α [49], которое блокирует рециклинг этого важнейшего компонента кэп-зависимой инициации трансляции. Инфекция VSV не вызывает фосфорилирования eIF2α, по крайней мере, до поздней стадии инфекции [49].

Вероятным объяснением механизма подавления репликации ВВС ингибиторами протеасом является генерация стресса в клетках со сниженной протеасомной активностью [47].В наших экспериментах клетки HeLa, обработанные MG132 и бортезомибом, реагировали накоплением шаперонного белка hsp70, фосфорилированием eIF2α и подавлением общей трансляции. В соответствии с ролью GCN2 в стрессе, индуцированном MG132 [47], действие ингибиторов протеасом на репликацию ВВС зависело от активности GCN2 в процессе ингибирования трансляции стрессом. Активность GCN2 защищала фибробласты от инфекции VSV [59], а пагубное влияние ингибиторов протеасом на репликацию VSV было сильнее в клетках дикого типа GCN2+/+ MEF, чем в клетках GCN2-/- MEF, где MG132-специфическое ослабление трансляции и фосфорилирование eIF2α не были эффективными. .Это прямое указание на то, что основной причиной ингибирования репликации ВВС является стресс. Стресс может быть более сильным в обработанных MG 132 клетках, инфицированных VSV. В этих клетках имеется множество вновь синтезированных белков, которые должны быть свернуты с помощью шаперонов. Ингибирование протеасом увеличивало количество неправильно расположенных развернутых клеточных и вирусных белков. Вирусная инфекция может также препятствовать дополнительному синтезу клеточных шаперонов, усиливающих связанное со стрессом ингибирование трансляции.Это зависимое от eFI2α-фосфорилирования ингибирование трансляции влияет на трансляцию клеточных мРНК, а также мРНК VSV. Неэффективная трансляция мРНК ВВС снижает количество вновь синтезированной РНК-полимеразы L, что дополнительно влияет на синтез вирусной мРНК и белков. В результате репликация вируса снизилась до 100 раз, что защищает клетки от некоторых токсических эффектов инфекции VSV. Хотя мы не изучали кинетику репликации VSV в клетках, обработанных MG132, даже после ночного заражения маркеры вирусной инфекции были значительно подавлены в клетках со сниженной протеасомной активностью.Таким образом, ингибирование протеасом может представлять собой новый терапевтический подход против некоторых вирусных инфекций, таких как VSV.

В отличие от клеточного синтеза белка и синтеза белка вируса полиомиелита, синтез белка полиовируса замедлялся только за счет ингибирования протеасом. Аналогичные задержки репликации были зарегистрированы для вируса Синдбис в результате стресса, вызванного брефельдином А [60], и для полиовируса в клетках, обработанных ингибитором РНК-хеликазы eIF4A [61]. Хотя механизм задержки находится в стадии изучения, низкая чувствительность полиовирусной инфекции к стрессу, вызванному ингибитором протеасом, может быть связана с его IRES-зависимой трансляцией.Связанное со стрессом фосфорилирование eIF2α снижает общий уровень трансляции, но при стрессе повышается эффективность трансляции ряда клеточных мРНК [62]–[64]. Клеточные шапероны hsp70 и GRP78, транспортер нейтральных аминокислот SNAT2 входят в число генов, экспрессия которых увеличивается при таком стрессе [35], [62], [62]–[67]. IRES-зависимая инициация трансляции представляет собой механизм, поддерживающий трансляцию во время стресса [68], [69]. IRES-зависимая трансляция меньше зависит от стандартных факторов инициации трансляции.Трансляция из IRES дицистовирусов не требует каких-либо факторов инициации трансляции [70], [71]. Трансляция из IRES HCV устойчива к снижению количества eIF2α [72], [73]. Полиовирусная инфекция стимулировала фосфорилирование eIF2α [50]. Мы предполагаем, что IRES-зависимая трансляция полиовируса придает устойчивость к ингибированию трансляции, стимулируемому стрессом из-за лечения протеасомным ингибитором. Хотя для изучения деталей этого эффекта потребуются дополнительные исследования, он может представлять собой общий механизм устойчивости вируса к стрессу.

Таким образом, ингибирование протеасом инициировало стрессовые процессы в клетках. Эти процессы включали GCN2-специфическое фосфорилирование eIF2α, ингибирование общей трансляции и накопление шаперонного белка hsp70. Хотя стресс является общим ингибитором репликации вируса, его эффективность для некоторых вирусов различается. Кэп-зависимая трансляция мРНК ВВС чувствительна к стрессу, и, как следствие, ингибирование протеасом оказывает вредное влияние на репликацию ВВС.Напротив, кэп-независимая IRES-зависимая трансляция РНК полиовируса была менее чувствительна к стрессу, вызываемому ингибиторами протеасом и репликацией полиовируса. В результате репликация полиовируса была задержана, но не устранена в клетках HeLa, обработанных MG132 и бортезомибом. Чтобы дополнительно обосновать это объяснение, мы изучаем влияние подобных стрессов на другие пикорнавирусы и рабдовирусы.

Материалы и методы

Культура клеток, трансфекция ДНК, вирусная инфекция и титрование

HeLa, wt GCN2+/+ MEF и GCN2-/- MEF культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Invitrogen/Gibco BRL), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки.Клетки HeLa инфицировали штаммом Mahoney полиовируса типа 1 при входной множественности заражения (MOI) 5 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/клетку в течение 1–6 ч [74]. Клетки HeLa и MEF инфицировали штаммом VSV New Jersey в дозе 5 БОЕ/клетку в течение 1–5 ч или в дозе 1 БОЕ/клетку в течение ночи. Для титрования полиовируса 10-кратные серийные разведения (от 1∶10 до 1∶10 9 ) культуральной среды дважды добавляли к клеткам HeLa, культивируемым в 48-луночных планшетах. Титр полиовируса определяли по цитопатическим эффектам, видимым через 3 дня.Титр VSV определяли в двух повторностях путем анализа бляшек 10-кратных серийных разведений (от 1∶10 4 до 1∶10 7 ) культуральной среды. MG132 и протеасомный ингибитор 1 были получены от Calbiochem. Бортезомиб был предоставлен больницей Розуэлл Парк.

Вестерн-иммуноблоттинг

Экстракты общего белка из клеток HeLa и BHK готовили в буфере RIPA (150 мМ NaCl, 1% SDS, 10 мМ Трис (pH 8,0), 1% дезоксихолат натрия, 1% NP-40), содержащем коктейль ингибиторов протеаз (Sigma) .Белковые экстракты разделяли электрофорезом в полиакриламидных гелях с градиентом 4–20% с SDS (Invitrogen/Novex), а затем переносили на нейлоновые мембраны PVDF (Amersham). Были использованы следующие антитела: антитела к P- и N-белку VSV, полученные путем иммунизации кроликов, мышиные моноклональные антитела к белку 3A были подарены доктором К. Киркегором, кроличьи антитела к белку 3C были подарены доктором BL Semler, антитела против капсидных белков полиовируса, полученные путем иммунизации кроликов очищенным полиовирусом, мышиные антитела против p220 eIF4G были подарком от Dr.Т. Пестова, кроличьи антитела к С-концу p65-RelA (Santa Cruz Biotechnology), анти-IκBα кроличьи антитела (Santa Cruz Biotechnology), антиактиновые кроличьи антитела (Santa Cruz Biotechnology), анти-GCN2 кроличьи антитела (Santa Cruz Biotechnology). ) и кроличьи антитела против hsp70 (Assay Designs/StressGen). Фосфорилирование eIF2α исследовали с помощью специфичных антител к eIF2α и eIF2α-фосфату (Cell Signaling Technology). Иммунные комплексы визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции (PerkinElmer Life Sciences).Контроль содержания белка в геле осуществляли с помощью кроличьих антител к Hsp90 (Abcam, Inc), кроличьих антител к тубулину (Santa Cruz Biotechnology) и кроличьих антител к кератину 18 (подарок доктора Р. Осима). . Конъюгированные с HRP вторичные антикроличьи и антимышиные антитела были приобретены у Santa Cruz Biotechnology. Интенсивность полос определяли количественно с использованием программного обеспечения NIH ImageJ для расчета процента накопления белка (acc), расщепления (cl), фосфорилирования (Phosp) или ингибирования синтеза белка (inh).

Нозерн-блоттинг

Тотальную РНК из инфицированных полиовирусом или VSV клеток HeLa анализировали с помощью Нозерн-блот-гибридизации с зондами, специфичными к РНК полиовируса (3C-кодирующий ПЦР-фрагмент), кДНК P-белка VSV и гену GAPDH. Фрагмент ПЦР получали из геномной кДНК полиовируса с праймерами, специфичными для кодирующей последовательности полиовируса 3C (3Cs 5′ GGG CCT GGG TTT GAC TAT 3′; 3Ca 5′ TTG GCT CTG AGT GAA GTA TGA 3′). Зонд кДНК P-белка VSV был получен с помощью ПЦР из плазмиды, содержащей геномную кДНК VSV с праймерами, соответствующими 5′- и 3′-концам кДНК P-белка (P-VSVs 5′ GAC ACA GAA TCT GAA CCA GAA ATT GAA 3 ‘, P-VSVa 5′ TTA TGA GAC ATT CGT CCG TTA CCT CCG 3’).Количественную оценку сигналов гибридизации проводили с помощью программного обеспечения NIH ImageJ.

In vivo S

35 — мечение белков и иммунопреципитация

клетки HeLa инфицировали VSV или полиовирусом в течение указанного времени и обрабатывали MG132. Обычную среду заменяли на среду, не содержащую метионин/цистеин, с добавлением метионина S 35 и цистеина S 35 (50 мкКи/мл) (New England Nuclear), и клетки инкубировали в течение 30 мин.Экстракты цитоплазматических белков из клеток HeLa очищали по протоколу Dignam [34]. Вирусные и клеточные белки осаждали из экстрактов цитоплазмы соответствующими антителами в течение ночи при 4°С. Комплексы антиген/антитело очищали на протеин А-сефарозе (Sigma) в течение 1 ч инкубации. Элюированные белки анализировали электрофорезом и авторадиографией.

Адсорбция и интернализация полиовируса

Полиовирус

был помечен S 35 -метионин/цистеин во время репликации.Клетки HeLa инкубировали с меченым полиовирусом (MOI = 100) при 4°C в течение одного часа. Контрольные клетки промывали 3 раза холодным PBS и белковые экстракты собирали с помощью RIPA. Для оценки интернализации вируса после инкубации с меченым вирусом при 4°С среду меняли и клетки переносили при 37°С еще на один час. Клетки промывали 3 раза PBS и белковые экстракты собирали с помощью RIPA. Наличие меченных S 35 капсидных белков полиовируса анализировали с помощью электрофореза и авторадиографии.Интенсивность полос определяли количественно с использованием программного обеспечения NIH ImageJ для расчета процента адсорбции белка (ad) и интернализации (in).

Благодарности

Мы благодарны д-ру Т. Пестовой за предоставленные антитела к p220 eIF4G, д-ру К. Киркегор за предоставленные антитела против белка 3А, д-ру Б.Л. Семлеру за его подарок антител против белка 3C и доктору Р. Г. Осиме за подарок антител против кератина 18. Мы благодарны Hirock Dutta и Paramita Sen за их помощь в проведении экспериментов с VSV.

Авторские взносы

Инициатива и разработка экспериментов: NN AB AG KC RW. Выполняли опыты: Н.Н. Л.Н., ЭД. Проанализированы данные: НН ЛН АБ АГ ЭД КЦ РВ. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: NN AB KC RW. Написал статью: NN AB AG KC RW.

Каталожные номера

  1. 1. Вайсман А.М. (2001) Темы и вариации убиквитинизации. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 169–178.
  2. 2. Kloetzel PM (2001)Обработка антигена протеасомой.Nat Rev Mol Cell Biol 2: 179–187.
  3. 3. Roos-Mattjus P, Sistonen L (2004)Убиквитин-протеасомный путь. Энн Мед 36: 285–295.
  4. 4. Кребс Д.Л., Хилтон Д.Дж. (2001)Белки SOCS: негативные регуляторы передачи сигналов цитокинов. Стволовые клетки 19: 378–387.
  5. 5. Каралья М., Марра М., Пелайя Г., Маселли Р., Капути М. и др. (2005) Альфа-интерферон и его влияние на пути передачи сигнала. J Cell Physiol 202: 323–335.
  6. 6.Zhang HG, Wang J, Yang X, Hsu HC, Mountz JD (2004) Регуляция белков апоптоза в раковых клетках с помощью убиквитина. Онкоген 23: 2009–2015.
  7. 7. Hinault MP, Ben Zvi A, Goloubinoff P (2006)Шапероны и протеазы: факторы, контролирующие клеточную укладку белков при нейродегенеративных заболеваниях и старении. J Mol Neurosci 30: 249–265.
  8. 8. Esser C, Alberti S, Hohfeld J (2004)Сотрудничество молекулярных шаперонов с системой убиквитин/протеасома.Биохим Биофиз Акта 1695: 171–188.
  9. 9. Имаи Дж., Яширода Х., Маруя М., Яхара И., Танака К. (2003)Протеасомы и молекулярные шапероны: клеточный механизм, ответственный за свертывание и разрушение развернутых белков. Клеточный цикл 2: 585–590.
  10. 10. Hatakeyama S, Nakayama KI (2003)Убиквитинирование как система контроля качества внутриклеточных белков. J Biochem (Токио) 134: 1–8.
  11. 11. Томас М., Пим Д., Бэнкс Л. (1999)Роль взаимодействия E6-p53 в молекулярном патогенезе ВПЧ.Онкоген 18: 7690–7700.
  12. 12. Клингер П.П., Шуберт У. (2005)Убиквитин-протеасомная система в репликации ВИЧ: потенциальные мишени для антиретровирусной терапии. Expert Rev Anti Infect Ther 3: 61–79.
  13. 13. Shackelford J, Pagano JS (2005)Нацеливание вирусов на пути убиквитина в клетке-хозяине. Очерки биохимии 41: 139–156.
  14. 14. Томас М., Пим Д., Бэнкс Л. (1999)Роль взаимодействия E6-p53 в молекулярном патогенезе ВПЧ.Онкоген 18: 7690–7700.
  15. 15. Брезина Р., Шрамек С., Казар Дж. (1975) Селекция штамма Coxiella burnetii, устойчивого к хлортетрациклину. Acta Virol 19: 496.
  16. 16. Coll JM (1995)Гликопротеин G рабдовирусов. Арх Вирол 140: 827–851.
  17. 17. Барик С. (2004)Контроль репликации вируса РНК с несегментированной отрицательной цепью с помощью миРНК. Вирус Рез. 102: 27–35.
  18. 18. Mathur M, Das T, Banerjee AK (1996)Экспрессия белка L вируса везикулярного стоматита серотипа Indiana из рекомбинантного бакуловируса в клетках насекомых: потребность в факторе(ах) хозяина для его биологической активности in vitro.Дж. Вирол 70: 2252–2259.
  19. 19. Sleat DE, Banerjee AK (1993)Транскрипционная активность и мутационный анализ рекомбинантной РНК-полимеразы вируса везикулярного стоматита. Дж. Вирол 67: 1334–1339.
  20. 20. Ахмед М., Маккензи М.О., Пакетт С., Хойнацки М., Поликуин Л. и др. (2003) Способность матричного белка вируса везикулярного стоматита подавлять экспрессию гена бета-интерферона генетически коррелирует с ингибированием РНК хозяина и синтеза белка.Дж. Вирол 77: 4646–4657.
  21. 21. Yuan H, Puckett S, Lyles DS (2001)Ингибирование транскрипции хозяина вирусом везикулярного стоматита включает новый механизм, который не зависит от фосфорилирования TATA-связывающего белка (TBP) или ассоциации TBP с субъединицами фактора, ассоциированного с TBP. Дж. Вирол 75: 4453–4458.
  22. 22. Yuan H, Yoza BK, Lyles DS (1998)Ингибирование зависимой от РНК-полимеразы II транскрипции вирусом везикулярного стоматита является результатом инактивации TFIID.Вирусология 251: 383–392.
  23. 23. Ahmed M, Lyles DS (1998) Влияние матричного белка вируса везикулярного стоматита на транскрипцию, управляемую РНК-полимеразами I, II и III хозяина. Дж. Вирол 72: 8413–8419.
  24. 24. Melnick JL, Phillips CA (1970)Энтеровирусы: вакцины, эпидемиология, диагностика, классификация. CRC Crit Rev Clin Lab Sci 1: 87–118.
  25. 25. Kaplan G, Lubinski J, Dasgupta A, Racaniello VR (1985)Синтез in vitro РНК инфекционного полиовируса.Proc Natl Acad Sci U S A 82: 8424–8428.
  26. 26. Schmid M, Wimmer E (1994)Контролируемый IRES синтез белка и репликация генома полиовируса. Приложение Arch Virol 9279–289.
  27. 27. Hellen CU, Facke M, Krauslich HG, Lee CK, Wimmer E (1991) Характеристика протеиназы полиовируса 2A с помощью мутационного анализа: остатки, необходимые для аутокаталитической активности, необходимы для индукции расщепления полипептида р220 эукариотического фактора инициации 4F. Дж. Вирол 65: 4226–4231.
  28. 28. Ю С.Ф., Ллойд Р.Е. (1991)Идентификация остатков незаменимых аминокислот в функциональной активности протеазы полиовируса 2А. Вирусология 182: 615–625.
  29. 29. Hicke L, Dunn R (2003) Регуляция транспорта мембранных белков с помощью убиквитина и убиквитин-связывающих белков. Annu Rev Cell Dev Biol 19: 141–172.
  30. 30. Клингер П.П., Шуберт У. (2005)Убиквитин-протеасомная система в репликации ВИЧ: потенциальные мишени для антиретровирусной терапии.Expert Rev Anti Infect Ther 3: 61–79.
  31. 31. Ott DE, Coren LV, Sowder RC, Adams J, Schubert U (2003) Ретровирусы предъявляют различные требования к функции протеасом в процессе почкования. Дж. Вирол 77: 3384–3393.
  32. 32. Ватанабе Х., Танака Ю., Симадзу Ю., Сугахара Ф., Куваяма М. и др. (2005) Специфическое для клеток ингибирование созревания парамиксовируса ингибиторами протеасом. Микробиол Иммунол 49: 835–844.
  33. 33. Харти Р.Н., Браун М.Е., МакГеттиган Дж.П., Ван Г., Джаякар Х.Р. и др.(2001)Рабдовирусы и клеточная убиквитин-протеасомная система: зарождающееся взаимодействие. Дж. Вирол 75: 10623–10629.
  34. 34. Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG (1983)Точная инициация транскрипции РНК-полимеразой II в растворимом экстракте из изолированных ядер млекопитающих. Нуклеиновые кислоты Рез. 11: 1475–1489.
  35. 35. Митсиадес Н., Митсиадес С.С., Пулаки В., Чаухан Д., Фануракис Г. и соавт. (2002)Молекулярные последствия ингибирования протеасом в клетках множественной миеломы человека.Proc Natl Acad Sci U S A 99: 14374–14379.
  36. 36. Karin M, Ben Neriah Y (2000) Фосфорилирование встречается с убиквитинированием: контроль активности NF-[каппа] B. Annu Rev Immunol 18: 621–663.
  37. 37. Незнанов Н., Чумаков К.М., Незнанова Л., Алмасан А., Банерджи А.К., и соавт. (2005)Протеолитическое расщепление субъединицы p65-RelA NF-каппа B во время полиовирусной инфекции. J Biol Chem 280: 24153–24158.
  38. 38. Lloyd RE, Grubman MJ, Ehrenfeld E (1988)Связь расщепления p220 во время пикорнавирусной инфекции с секвенированием протеиназы 2A.Дж. Вирол 62: 4216–4223.
  39. 39. Krauslich HG, Nicklin MJ, Toyoda H, Etchison D, Wimmer E (1987)Полиовирусная протеиназа 2A индуцирует расщепление полипептида p220 эукариотического фактора инициации 4F. Дж. Вирол 61: 2711–2718.
  40. 40. Frielle DW, Kim PB, Keene JD (1989)Ингибирующее действие вируса везикулярного стоматита на метаболизм клеточной и вирусной РНК и синтез белка. Вирусология 172: 274–284.
  41. 41. Desforges M, Charron J, Berard S, Beausoleil S, Stojdl DF, et al.(2001) Различные стратегии отключения клеток-хозяев, связанные с матриксным белком, приводят к персистенции мутантов вируса везикулярного стоматита на клетках фибробластов. Вирус Рез. 76: 87–102.
  42. 42. Buckley B, Ehrenfeld E (1987)Кэп-связывающий белковый комплекс в неинфицированных и инфицированных полиовирусом клетках HeLa. J Biol Chem 262: 13599–13606.
  43. 43. Bonneau AM, Darveau A, Sonenberg N (1985)Влияние вирусной инфекции на синтез белка хозяина и ассоциацию мРНК с цитоплазматической структурой цитоскелета.J Cell Biol 100: 1209–1218.
  44. 44. Wek RC, Jiang HY, Anthony TG (2006)Преодоление стресса: киназы eIF2 и контроль трансляции. Biochem Soc Trans 34: 7–11.
  45. 45. Holcik M, Sonenberg N (2005)Контроль трансляции при стрессе и апоптозе. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 318–327.
  46. 46. Proud CG (2005) eIF2 и контроль клеточной физиологии. Semin Cell Dev Biol 16: 3–12.
  47. 47. Jiang HY, Wek RC (2005)Фосфорилирование альфа-субъединицы эукариотического фактора инициации-2 (eIF2alpha) снижает синтез белка и усиливает апоптоз в ответ на ингибирование протеасом.J Biol Chem 280: 14189–14202.
  48. 48. He B (2006)Вирусы, стресс эндоплазматического ретикулума и интерфероновые реакции. Cell Death Differ 13: 393–403.
  49. 49. Connor JH, Lyles DS (2005)Ингибирование хозяина и вирусной трансляции во время заражения вирусом везикулярного стоматита. eIF2 отвечает за ингибирование трансляции вируса, но не хозяина. J Biol Chem 280: 13512–13519.
  50. 50. O’Neill RE, Racaniello VR (1989)Ингибирование трансляции в клетках, инфицированных мутантным полиовирусом 2Apro, коррелирует с фосфорилированием альфа-субъединицы эукариотического фактора инициации 2.Дж. Вирол 63: 5069–5075.
  51. 51. Луо Х., Чжан Дж., Чунг С., Суарес А., Макманус Б.М. и др. (2003)Ингибирование протеасом снижает репликацию вируса Коксаки B3 в мышиных кардиомиоцитах. Ам Дж. Патол 163: 381–385.
  52. 52. Wang J, Maldonado MA (2006)Убиквитин-протеасомная система и ее роль в воспалительных и аутоиммунных заболеваниях. Селл Мол Иммунол 3: 255–261.
  53. 53. Спатаро В., Норбери С., Харрис А.Л. (1998)Убиквитин-протеасомный путь при раке.Бр Дж. Рак 77: 448–455.
  54. 54. Имаи Дж., Яширода Х., Маруя М., Яхара И., Танака К. (2003)Протеасомы и молекулярные шапероны: клеточный механизм, ответственный за свертывание и разрушение развернутых белков. Клеточный цикл 2: 585–590.
  55. 55. Qian SB, Princiotta MF, Bennink JR, Yewdell JW (2006) Характеристика быстро деградирующих полипептидов в клетках млекопитающих раскрывает новый уровень контроля качества зарождающихся белков. J Biol Chem 281: 392–400.
  56. 56.Cowan JL, Morley SJ (2004)Ингибитор протеасом, MG132, способствует перепрограммированию трансляции в миобластах C2C12 и облегчает ассоциацию hsp25 с комплексом eIF4F. Eur J Biochem 271: 3596–3611.
  57. 57. Rahmani M, Davis EM, Bauer C, Dent P, Grant S (2005)Апоптоз, индуцированный ингибитором киназы BAY 43-9006 в клетках лейкемии человека, включает подавление Mcl-1 посредством ингибирования трансляции. J Biol Chem 280: 35217–35227.
  58. 58.Clemens MJ (2005)Контроль трансляции в инфицированных вирусом клетках: модели клеточных реакций на стресс. Semin Cell Dev Biol 16: 13–20.
  59. 59. Berlanga JJ, Ventoso I, Harding HP, Deng J, Ron D, et al. (2006) Противовирусный эффект фактора инициации трансляции 2 альфа-киназы GCN2 млекопитающих против РНК-вирусов. EMBO J 25: 1730–1740.
  60. 60. Молина С., Санс М.А., Мадан В., Вентозо И., Кастелло А. и др. (2007)Дифференциальное ингибирование клеточной трансляции и трансляции вируса Синдбис брефелдином А.Вирусология 363: 430–436.
  61. 61. Бордело М.Е., Мори А., Оберер М., Линдквист Л., Чард Л.С. и соавт. (2006) Функциональная характеристика IRES с помощью ингибитора РНК-хеликазы eIF4A. Nat Chem Biol 2: 213–220.
  62. 62. Gaccioli F, Huang CC, Wang C, Bevilacqua E, Franchi-Gazzola R, et al. (2006) Аминокислотное голодание индуцирует переносчик нейтральных аминокислот SNAT2 по механизму, который включает фосфорилирование эукариотического фактора инициации 2альфа и кэп-независимую трансляцию.J Biol Chem 281: 17929–17940.
  63. 63. Холмберг С.И., Иллман С.А., Каллио М., Михайлов А., Систонен Л. (2000) Формирование ядерных гранул HSF1 варьируется в зависимости от стрессовых воздействий. Шапероны клеточного стресса 5: 219–228.
  64. 64. Fernandez J, Yaman I, Sarnow P, Snider MD, Hatzoglou M (2002) Регуляция внутренней трансляции, опосредованной сайтом входа рибосомы, путем фосфорилирования фактора инициации трансляции eIF2alpha. J Biol Chem 277: 19198–19205.
  65. 65.Рубцова М.П., ​​Сизова Д.В., Дмитриев С.Е., Иванов Д.С., Прасолов В.С. (2003) Отличительные свойства 5′-нетранслируемой области мРНК hsp70 человека. J Biol Chem 278: 22350–22356.
  66. 66. Johannes G, Sarnow P (1998)Cap-независимая полисомная ассоциация природных мРНК, кодирующих c-myc, BiP и eIF4G, обусловленная внутренними сайтами посадки рибосом. РНК 4: 1500–1513.
  67. 67. Yang Q, Sarnow P (1997) Расположение внутреннего сайта посадки рибосомы в 5′-некодирующей области мРНК белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулина (BiP): свидетельство специфических взаимодействий РНК-белок.Нуклеиновые кислоты рез. 25: 2800–2807.
  68. 68. Пикеринг Б.М., Уиллис А.Е. (2005)Влияние структурированных 5′-нетранслируемых областей на трансляцию и болезни. Semin Cell Dev Biol 16: 39–47.
  69. 69. Комар А.А., Хацоглу М. (2005)Внутренние сайты входа рибосом в клеточные мРНК: тайна их существования. J Biol Chem 280: 23425–23428.
  70. 70. Sasaki J, Nakashima N (1999) Инициация трансляции в кодоне CUU опосредована внутренним сайтом входа в рибосомы пикорноподобного вируса насекомых in vitro.Дж. Вирол 73: 1219–1226.
  71. 71. Wilson JE, Powell MJ, Hoover SE, Sarnow P (2000) РНК вируса дицистронного паралича сверчков природного происхождения регулируется двумя внутренними сайтами входа в рибосомы. Мол Селл Биол 20: 4990–4999.
  72. 72. Джексон Р.Дж. (2005)Альтернативные механизмы инициации трансляции мРНК млекопитающих. Biochem Soc Trans 33: 1231–1241.
  73. 73. Роберт Ф., Капп Л.Д., Хан С.Н., Акер М.Г., Колиц С. и соавт. (2006) Инициация синтеза белка вирусом гепатита С невосприимчива к уменьшению eIF2.Наличие тройного комплекса GTP.Met-tRNA(i)(Met). Мол Биол Ячейка 17: 4632–4644.
  74. 74. Незнанов Н., Кондратова А., Чумаков К.М., Ангрэс Б., Жумабаева Б. и др. (2001) Полиовирусный белок 3А ингибирует апоптоз, индуцированный фактором некроза опухоли (ФНО), удаляя рецептор ФНО с ​​клеточной поверхности. Дж. Вирол 75: 10409–10420.

Добавление генов в РНК-геном вируса везикулярного стоматита: позиционные эффекты на стабильность экспрессии рабдовирус,

Вирус везикулярного стоматита (VSV).VSV имеет геном РНК отрицательного смысла длиной 11 т.п.н. На 3′-конце генома находится лидерная последовательность РНК из 47 нуклеотидов (нт), за которой по порядку следуют пять генов, кодирующих вирусный нуклеокапсидный белок (N), фосфопротеин (P), матричный белок (M), присоединяющий гликопротеин. (G) и вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (L), и заканчивается 54-нуклеотидной 5′-концевой последовательностью РНК (23). Лидерная последовательность содержит элементы, необходимые для связывания полимеразы и для передачи сигналов репликации и транскрипции (16, 35).Трейлер содержит последовательности, необходимые для репликации, а также -цис--действующий сигнал для сборки вновь реплицированных РНК в частицы (15, 35). Впервые было показано с помощью VSV, что транскрипция вирусов NNS РНК инициируется на единственном 3′-конце. проксимальный промоторный сайт и что моноцистронные мРНК генерируются путем обязательной последовательной транскрипции каждого из генов (1, 3). В рамках единственного сайта посадки полимеразы имеются консервативные последовательности в начале и конце каждого гена и в местах соединения генов, которые сигнализируют об инициации и терминации каждой мРНК (4-6, 29, 30).Кроме того, терминация транскрипции каждого гена выше по течению необходима для инициации следующего гена ниже по течению, что согласуется с последовательной природой транскрипции (5). Транскрипция является основным этапом, на котором контролируется экспрессия генов VSV. Проксимальный ген промотора транскрибируется в наибольшем количестве, и каждый последующий нижестоящий ген транскрибируется в прогрессивно меньших количествах (31). Это снижение выхода транскриптов называется аттенуацией (14). Это происходит специфически, когда полимераза пересекает каждое соединение генов, что приводит к уменьшению нижестоящего продукта примерно на 25-30% и, как полагают, происходит из-за диссоциации полимеразы на каком-то этапе терминации или повторной инициации (14).Последовательности на конце каждого гена, межгенный динуклеотид и начало нижнего гена, называемые вместе генными соединениями, хорошо консервативны в VSV (23). Обширный мутагенез соединения генов идентифицировал последовательности, которые необходимы для полиаденилирования мРНК, терминации и последующей инициации, а также модификации (5, 6, 13, 28-30). Последовательности, необходимые для терминации и полиаденилирования, представляют собой консервативную последовательность 3’…AUACUUUUUUU…5′, обнаруженную в конце каждого гена, и первый нуклеотид межгенного динуклеотида 3′..GA..5′ (5, 6, 29). Замена любого нуклеотида AUAC снижает эффективность терминации, а замена остатка C на любой другой нуклеотид отменяет терминацию. Сходным образом укорачивание тракта U7 даже на один нуклеотид или прерывание его гетерологичным нуклеотидом устраняет терминацию и полиаденилирование (5). Более того, базовый состав тетрануклеотида AUAC контролирует способность полимеразы скользить по тракту U7 и генерировать полиаденилатные хвосты (4).Первоначально было показано, что транскрипция каждой нижестоящей мРНК требует, чтобы последовательность 3’…UUGUCNN…5′ сохранялась в начале каждого гена и на нее влиял второй нуклеотид межгенного динуклеотида (6, 29, 30). Недавняя работа показала, что в процесс вовлечены и другие восходящие последовательности (9a). Как упоминалось выше, терминация каждого восходящего гена необходима для того, чтобы полимераза могла транскрибировать ген непосредственно нижестоящим. Если полимеразе не удается терминировать конец гена, она затем считывает соединение генов и синтезирует считываемую РНК, а не моноцистронную мРНК из нижестоящего гена.Контролируемая экспрессия генов важна для жизненного цикла вируса. Например, количество белка N имеет решающее значение для оптимальной репликации генома, как было показано ранее путем создания сконструированных VSV, в которых положение гена N было изменено с его 3′-проксимального положения на последовательные дистальные положения (33). Мы обнаружили, что транскрипция гена N снижалась ступенчато по мере того, как ген N последовательно перемещался в промоторно-дистальные положения, и, соответственно, общая репликация вирусного генома ступенчато снижалась (33).Таким образом, репликативную способность этих вирусов можно контролировать, изменяя уровень транскрипции этого ключевого гена.

В настоящей работе мы протестировали несколько аспектов принципов, связанных с транскрипционным контролем экспрессии генов вирусов с отрицательной цепью РНК, путем вставки дополнительной транскрипционной единицы в каждое соединение генов VSV. Это позволило нам проверить, контролирует ли положение, в котором был помещен ген, уровни экспрессии и могут ли все соединения вирусных генов одинаково легко принять дополнительный ген.

Гетерологичные гены были экспрессированы из VSV и многих других РНК-вирусов NNS в различных положениях генома с различными результатами в отношении уровней экспрессии (7-9, 17, 24). Кроме того, эффекты добавления дополнительного гена на репликацию сильно различаются, в некоторых случаях практически не влияя, а в других вызывая более чем 100-кратное снижение репликации. В некоторых случаях, когда репликация была нарушена, продукт добавленного гена мог ингибировать репликацию. В других случаях изменения последовательности, такие как сайты рестрикционных ферментов, введенные во время клонирования, могли повлиять на уровень репликации или экспрессии.Однако до настоящего времени ни в одном случае не были исследованы экспрессия и стабильность идентичного гена со всех доступных позиций.

В работе, о которой здесь сообщается, мы сравнили влияние вставки идентичной транскрипционной единицы идентичным образом без изменения последовательностей соединений генов в каждом из соединений генов на стабильность генома, стабильность экспрессии и влияние на репликацию вируса. . Важно отметить, что добавленная единица транскрипции была разработана таким образом, чтобы не экспрессировать белковый продукт, который мог бы придать вирусу избирательное преимущество или недостаток.Единица транскрипции, добавленная к каждому из внутренних соединений гена VSV, содержала консервативные последовательности начала и конца транскрипции VSV, но не имела последовательности инициации трансляции или основной открытой рамки считывания, таким образом избегая возможности обратной связи белкового продукта, влияющего на любой этап транскрипции или репликация. Кроме того, транскрипцию анализировали путем метаболического мечения мРНК, что позволило нам напрямую сравнивать вирусные транскрипты и избежать вопросов относительной эффективности трансляции, функциональности или стабильности белка, которые могут возникнуть при измерении белковых продуктов или активности ферментов.

Наши результаты показывают, что положение вставки определяет уровень экспрессии дополнительного гена и, кроме того, добавленный ген стабильно сохраняется во всех положениях генома. Однако только определенные позиции в геноме стабильно поддерживали экспрессию дополнительной транскрипционной единицы. Молекулярный анализ геномов вирусной популяции, эволюционировавшей для подавления экспрессии добавленного гена, показал, что механизм подавления добавленного гена заключается в быстром отборе мутаций, которые отменяют терминацию вышестоящего гена и тем самым подавляют инициацию нижестоящей моноцистронной мРНК.Эти данные способствовали нашему пониманию контроля транскрипции и показали, что терминация транскрипции является ключевым этапом, на котором контроль нижестоящей экспрессии генов может эффективно регулироваться в пределах одного промотора транскрипции.

Эти результаты имеют прямое отношение к использованию вирусов NNS в качестве векторов и средств доставки вакцин, поскольку они показывают, что уровень экспрессии добавленного гена можно контролировать с помощью положения, в котором он вставлен; однако они также показывают, что не все положения вставки стабильны для экспрессии гетерологичного гена.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки и вирусы.

Линия клеток почки детеныша хомяка (BHK-21) использовалась для трансфекции, выращивания вируса, одностадийного анализа роста и метаболического анализа вирусной РНК и синтеза белка. Пулы вирусов титровали на клетках VERO 76. Вирус, имеющий порядок генов дикого типа, был получен из инфекционного клона кДНК VSV-IN, как описано ранее (2, 33, 34). Из соответствующих клонов кДНК мы также выделили вирусы с геномами, которые содержали дополнительную гетерологичную транскрипционную единицу на каждом из четырех внутренних соединений генов.Эти клоны кДНК были сконструированы путем поэтапной сборки клонированных фрагментов кДНК, которые представляли отдельные гены VSV или гетерологичную единицу транскрипции, как описано ранее (2). Этот метод реконструировал межгенные соединения дикого типа и оставил неизменной нуклеотидную последовательность вирусного генома, за исключением введения гетерологичной единицы транскрипции. Он состоял из первых 7 нуклеотидов гена M VSV-IN, за которыми следовали 602 нуклеотида, полученные из генома бактериофага φX174 (φX174 нуклеотиды от 1174 до 1775), окруженные линкером Xho I (CCCTCGAGGG), за которыми, в свою очередь, следовали последние 32 нуклеотида гена VSV-IN (Orsay) G.Мы сконструировали четыре различных инфекционных клона кДНК, содержащих эту кассету в межгенных соединениях NP, PM, MG или GL, и назвали восстановленные вирусы NIP, PIM, MIG и GIL соответственно. Эти вирусы были извлечены путем трансфекции, как описано ранее (2, 34). Как и в нашей предыдущей работе, межгенный динуклеотид был сделан 3′..GA..5′ на всех четырех соединениях генов (2).

Одноцикловый анализ роста репликации вируса.

Одноэтапный анализ роста был проведен в клетках BHK, инфицированных с множественностью 3 точно так, как описано ранее (33).

Анализ синтеза РНК. Синтез РНК

анализировали путем прямого метаболического мечения клеток, инфицированных указанным вирусом, при множественности 5 (см. рис. 1) или 10 (см. рис. 3). Клетки подвергали воздействию [ 3 H]уридина в течение 2,5 ч (33 мкКи/мл) в присутствии актиномицина D (10 мкг/мл). Собирали клетки, готовили цитоплазматические экстракты и анализировали РНК с помощью гель-электрофореза, как описано ранее (33). Авторадиограммы флюорографических гелей количественно оценивали с использованием денситометра PDI 320i.Молярные количества видов РНК количественно определяли на основе содержания в них уридина. Представленные результаты являются репрезентативными как минимум для трех независимых экспериментов. РНКаза H направляет расщепление РНК после отжига со специфическими олигонуклеотидами ([ген, нуклеотиды, полярность] N, 336–351, –; P, 1420–1437, –; вставка PhiX, 5’GCGCCAGTATTAACAGTCG3’, –; L, 7580–7599 , +) проводили, как описано ранее, и продукты расщепления извлекали и анализировали с помощью гель-электрофореза и флюорографии (6).

Анализ синтеза вирусного белка.

Синтез белка, направляемый каждым из выздоровевших вирусов, измеряли в клетках ВНК, инфицированных с множественностью 20. Через 5 ч после инфицирования клетки промывали и инкубировали в среде без метионина в течение 30 мин. Затем их подвергали воздействию [ 35 S] метионина (30 мкКи/мл) в течение 30 мин. В конце периода мечения клеточные монослои собирали непосредственно в буфер для загрузки геля и разделяли на 10% полиакриламидном геле с низким содержанием бис, как описано ранее (33).Вирусные белки количественно определяли с помощью фосфорно-импульсного анализа авторадиограмм высушенных гелей и определяли молярные количества белков.

Анализ последовательности вирусных геномов.

РНК из вируса, выделенного из надосадочной жидкости, экстрагировали, и центральную область генома анализировали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей и олигонуклеотидных праймеров из гена N (1027–1046; +) и от гена М (с 2271 по 2290; -). Последовательность каждого соединения генов и окружающей области анализировали в обоих направлениях с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров (ген, нуклеотиды, полярность): N, 1027-1046, +; N, 1321–1376, —; вставка PhiX, 5’GCGCCAGTATTAACAGTCG3′, -; П, с 1420 по 1437, -; П, с 1464 по 1488, +; П, 154 до 1562, +; М, с 2271 по 2290, −.Автоматизированный анализ последовательности проводили на секвенаторе Perkin-Elmer Applied Biosystems 377.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние положения вставки дополнительного гена на уровни экспрессии.

Мы вставили дополнительную единицу транскрипции из 661 нуклеотида, содержащую консервативные последовательности начала и конца гена VSV, в каждое из четырех соединений генов инфекционной кДНК генома VSV. Это было сделано без внесения изменений в консервативные последовательности соединений генов (см. Материалы и методы).Инфекционные вирусы были выделены из каждой из четырех кДНК путем трансфекции соответствующей плазмиды в клетки вместе с плазмидами, кодирующими белки N, P и L VSV, как описано ранее (34). Выздоровевшие вирусы были обозначены в соответствии с положением, в котором была помещена вставленная единица транскрипции «I» (также называемая геном I): NIP для вируса с геном, вставленным между генами N и P, и PIM, MIG. и GIL для вирусов, имеющих дополнительный ген, встроенный между генами P и M, M и G и G и L соответственно, как показано на рис.1A. Влияние положения вставки на экспрессию встроенного гена исследовали путем прямого метаболического мечения РНК [ 3 H]уридином в присутствии актиномицина D в инфицированных клетках BHK. В дополнение к синтезу вирусной геномной РНК и моноцистронных мРНК, транскрибируемых с вирусных генов L, G, N, P и M, РНК из встроенного гена I мигрировала немного быстрее, чем вирусные P и M мРНК. Рисунок 1). Относительное количество мРНК I варьировало в зависимости от положения, в котором ген был вставлен в геном.Наиболее обильный синтез РНК возникает в результате вставки гена в самый 3′-сайт между генами N и P, а последовательно меньшие количества возникают в результате вставки между последующими парами генов (рис. 1). Количественное определение молярных количеств мРНК I по отношению к 3′-проксимальной мРНК N показало прогрессирующее снижение синтеза (рис. 1), что соответствовало ослаблению транскрипции на каждом стыке генов примерно на 30% (6, 14). . Эти данные подтверждают, что экспрессия генов контролируется положением гена относительно 3′-промотора.

Влияние вставки дополнительных генов на репликацию вируса.

Вирусную репликацию исследовали путем анализа продукции потомства вируса в клетках BHK-21 в культуре. Все вирусы, имеющие дополнительный ген, реплицировались до уровней, сходных с уровнями вируса дикого типа (восстановленные из исходной кДНК без дополнительного гена), за исключением случая вируса NIP (рис. 2). Репликация вируса NIP была снижена в 10-30 раз по сравнению с вирусом дикого типа, что отражалось в уменьшении размера вирусной вспышки.Одним из объяснений сниженной репликации вируса NIP было то, что вставка дополнительного гена в геном вызовет дополнительный этап аттенуации транскрипции, специфичный для соединения, который должен снизить уровень экспрессии всех нижестоящих генов. Соответствующие относительные молярные соотношения белков N и P важны для репликации в VSV (12, 21). Вставка дополнительного гена между генами N и P не должна влиять на экспрессию гена N, но ожидается, что она уменьшит молярное количество белка P по сравнению с уровнем дикого типа.Это подтвердилось, как будет показано ниже.

Влияние пассажа на уровень репликации вируса.

Вирус, извлеченный, как указано выше, был подвергнут одному пассажу с низкой множественностью для получения пула вируса, подходящего для проведения экспериментов; это было названо исходным проходом (P0). Чтобы исследовать стабильность встроенного гена, стабильность его экспрессии и фенотип пониженной репликации, наблюдаемый у вирусов NIP по сравнению с тремя другими вирусами, мы пассировали вирусы еще два раза.Для этого четыре вируса пассировали однократно при низкой множественности заражения (0,005). Вирусы из этого пассажа (P1) затем выделяли полосами в градиентах скорости сахарозы для удаления любых возможных дефектных мешающих частиц, а второй пассаж (P2) проводили при низкой множественности, как указано выше. Вирусы из второго пассажа были охарактеризованы непосредственно для репликации в анализе одностадийного роста. В отличие от вируса NIP-P0 вирус NIP-P2 не проявлял дефицита репликации; он реплицировался до тех же уровней, что и вирус дикого типа (рис.2). Репликация вирусов PIM, MIG и GIL была практически такой же, как у вируса дикого типа как до, так и после пассирования (рис. 2).

РНК синтетический фенотип пассированных вирусов.

Были проанализированы структуры РНК, синтезированные пассированными вирусами в клетках BHK, и было обнаружено, что они не обнаруживают различий в случае дважды пассированных вирусов PIM-P2, MIG-P2 и GIL-P2 (рис. 3). Однако пассированный вирус NIP-P2, который ранее синтезировал самые высокие уровни мРНК I, теперь синтезировал едва определяемые уровни мРНК I и вместо этого образовывал большое количество РНК, которая мигрировала между мРНК L и G (рис.3А). Новая большая РНК характеризовалась гибридизацией со специфическими олигонуклеотидными зондами с последующим расщеплением РНКазой H и анализом геля, и было обнаружено, что она представляет собой бицистронную РНК, состоящую из N- и I-РНК. Большая РНК была специфически расщеплена РНКазой Н после отжига с олигонуклеотидом с отрицательным смыслом, специфичным к мРНК N или к мРНК I из вставленного гена (последовательность PhiX), но не после отжига с олигонуклеотидами с отрицательным смыслом, специфичным для гена P (последовательность PhiX). данные не показаны) или олигонуклеотиды с положительным смыслом, специфичные для L-последовательности (фиг.3Б). Размер большой РНК и тот факт, что она отжигается с олигонуклеотидными зондами, специфичными как для последовательностей N, так и для I, но не для зондов для последовательностей P, указывали на то, что это была сквозная РНК генов N и I. Обнаружение того, что она не отжигается с L-специфическим зондом положительного смысла, исключает возможность того, что это могла быть обычная интерферирующая РНК с дефектом 3′-копирования, которая могла возникнуть во время пассажа (10). Эти результаты были подтверждены RT-PCR и анализом последовательности, как описано ниже.

Скорость отбора ревертантов была неожиданной; поэтому мы вернулись к исходному вирусу NIP-P0 и повторили пассажи самостоятельно, точно так же, как это было сделано в первый раз. Вирус из второй независимой серии пассажей, NIP-P2.2, снова реплицировался так же, как и дикий тип. Фенотип синтеза РНК также демонстрировал тот же паттерн, что и наблюдаемый выше для NIP-P2, в том, что производилось мало моноцистронной мРНК I или не было вообще, а вместо этого в изобилии присутствовала бицистронная РНК NI (данные не показаны).

Вирусы PIM, MIG и GIL последовательно пассировали 10 раз при низкой множественности, как описано выше. Уровни их репликации и уровни экспрессии мРНК I оставались стабильными и неотличимыми от наблюдаемых на P0.

Последовательность ревертантных вирусных геномов.

Мы использовали ОТ-ПЦР для определения последовательности геномов ревертантных вирусов. Участок генома, простирающийся от конца гена N до начала гена М и включающий соединения генов N-I, I-P и P-M, был амплифицирован (рис.4). Последовательность этого продукта анализировали двумя способами. Сначала основной продукт ПЦР выделяли очисткой в ​​геле, а последовательность каждого соединения генов анализировали непосредственно для изучения последовательности вирусной популяции. Было обнаружено, что последовательность основного продукта ПЦР на стыке гена IP относится к дикому типу (рис. 4), как и последовательность соединения PM (данные не показаны). Однако последовательность на стыке N-I, которая в исходном вирусе явно была дикого типа с непрерывным трактом U7, была отчетливо гетерогенной в вирусах с двойным пассажем (рис.4C). Для определения последовательностей на стыках генов отдельных видов вирусов в гетерогенной популяции были проведены две независимые ОТ-ПЦР на геномах вирусных популяций, полученных из каждого из двух независимых пассажей, описанных выше: NIP-P2 и вирусы NIP-P2.2. Продукты ОТ-ПЦР были выделены и клонированы, и 35 независимых клонов ДНК (15 из NIP-P2 и 20 из NIP-P2.2) были выделены и секвенированы в обоих направлениях через соединения NI, I-P и PM.Резюме анализа последовательности показано в Таблице 1. Последовательность соединения P-M была дикого типа в 34 из 35 клонов. Один клон соединения P/M, который не был диким типом, имел тракт PM U7, расширенный до U8. Последовательность соединения IP была дикого типа в 33 из 35 клонов. В двух клонах, не относящихся к дикому типу, U-участок на стыке I-P был U8 в одном и U2CU4 в другом. Напротив, последовательность соединения NI была дикого типа только в 4 из 35 клонов; в остальных 31 клоне было несколько типов мутаций (табл. 1).Наиболее частым изменением у 14 из 35 было прерывание тракта U7 остатком C (U2CU4 или U4CU2). Вторым наиболее частым изменением (11 из 35) было укорочение U тракта до U6. Предыдущая работа показала, что тракт U7 необходим для терминации транскрипции. Прерывание U-тракта гетерологичным нуклеотидом или укорочение U-тракта даже на один нуклеотид отменяет проскальзывание и терминацию (5). Следующее наиболее распространенное изменение связано с изменениями тетрануклеотида AUAC, который предшествует тракту U7 (таблица 1), где любые изменения уменьшают терминацию (5).

Эти данные показывают, что мутации, которые, как известно, ингибируют терминацию транскрипции, были выбраны для соединения генов N-I в вирусе, который пассировали дважды. Два нижних соединения, исследованные в каждом из тех же клонов ДНК, соединения генов I-P и PM, накопили мутацию, которая устранила бы терминацию только в 1 из 70 исследованных последовательностей соединений. Поскольку последовательности на стыках генов VSV высококонсервативны, эти данные обеспечивают строгий внутренний контроль, показывающий, что изменения, наблюдаемые на стыке NI, не возникают из-за проскальзывания или ошибок в этих последовательностях ферментами, используемыми в RT или PCR.

В соответствии с обязательным последовательным характером транскрипции вирусов NNS, неспособность терминировать транскрипцию вышестоящего гена приводит к считыванию полимеразы на этом стыке и предотвращает инициацию полимеразы в гене непосредственно ниже по течению. Одновременно с этими открытиями последовательности мы наблюдали, что синтез моноцистронной мРНК I подавлялся в течение двух пассажей и что вместо этого в пассированных вирусах синтезировалась бицистронная РНК NI (рис. 3А). Эти результаты согласуются с концевыми мутациями гена N, исключающими терминацию и, как следствие, чтение полимеразой соединения генов с образованием полицистронной РНК.Это должно привести к устранению дополнительной стадии аттенуации, вызванной транскрипцией добавленного гена. Чтобы определить, так ли это, мы сравнили синтез белков из исходных изолятов вируса с таковым из дважды пассированного вируса.

Влияние встроенных генов на продукцию вирусного белка.

Влияние дополнительной транскрипционной единицы, встроенной в каждое из межгенных соединений VSV, на экспрессию вирусных белков исследовали в клетках BHK путем метаболического мечения [ 35 S]метионином.Вирусные белки анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и количественно определяли с помощью фосфорной визуализации, а относительные молярные количества каждого белка выражали в процентах от молярных соотношений вируса дикого типа. Молярное количество белков, экспрессируемых из генов, расположенных ниже встроенной единицы транскрипции в вирусе NIP-P0, снизилось примерно на 35% по сравнению с уровнями дикого типа (таблица 2). Это то, что можно было бы предсказать для вставки дополнительной единицы транскрипции в указанном положении.

Напротив, молярные количества всех белков ниже вставки гена I в NIP-P2 были восстановлены почти до уровней дикого типа. Эти данные согласуются с потерей экспрессии добавленного гена в виде моноцистронной мРНК и устранением сопутствующей аттенуации, которая происходит, когда полимераза терминирует транскрипцию вышестоящего гена, пересекает межгенное соединение и инициирует нижестоящий ген. Было обнаружено, что молярные количества белков, экспрессируемых из вирусов PIM, MIG и GIL, не изменились после двух пассажей, при этом молярные количества белков ниже встроенного гена по-прежнему снижены примерно на 30% по сравнению с уровнями дикого типа, что согласуется с стабильная экспрессия добавленного гена I из этих вирусов.

Эти данные показывают, что устранение терминации на конце гена N приводило к считыванию полимеразы в месте соединения NI и подавлению транскрипции моноцистронной I мРНК. Это устранило стадию аттенуации в этом соединении генов NI и восстановило уровни экспрессии всех белков ниже встроенной транскрипционной единицы почти до уровней дикого типа.

ОБСУЖДЕНИЕ

Чужеродные гены были экспрессированы из многих NNS РНК-вирусов из разных положений в геноме (7-9, 17, 24, 32).Во всех случаях добавленные гены стабильно сохранялись в геноме, но влияние добавленных генов на репликацию вируса было разным. В некоторых случаях, таких как добавление зеленого флуоресцентного белка к вирусу чумы крупного рогатого скота между генами P и M, репликация замедлялась, но в конечном итоге титры были сопоставимы с титрами вируса дикого типа (32). В других случаях, таких как добавление люциферазы светлячка к самому 3′-локусу вируса Сендай, репликация снижалась в два-четыре раза, а бляшки были меньше, тогда как в случае вируса ньюкаслской болезни добавление хлорамфениколацетилтрансферазы ( CAT) между двумя последними генами, HN и L, уменьшал репликацию в 100 раз (8, 17).Из этих отчетов не было получено четкой корреляции относительно влияния положения вставки дополнительного гена и потенциального воздействия на потенциал репликации вируса. Дополнительным соображением при оценке этих сообщений является то, что в некоторых случаях последовательность дикого типа сохранялась на стыках добавленных генов и вокруг них, тогда как в других случаях в последовательности были внесены изменения, которые могут играть регулирующую роль. Стабильность и экспрессия идентичного гена из всех доступных позиций в геноме NNS ранее не исследовались.

В работе, представленной здесь, мы вставили идентичную транскрипционную единицу в каждое из соединений генов VSV идентичным образом, так что в последовательности соединений генов не было внесено никаких изменений. Затем мы исследовали стабильность добавленного гена в геноме, стабильность экспрессии единицы транскрипции и влияние добавления гена в различные положения на репликацию вируса. Важным для эксперимента был тот факт, что добавленная единица транскрипции была спроектирована таким образом, чтобы не экспрессировать белковый продукт, который мог бы дать вирусу избирательное преимущество или недостаток.Представленные результаты показывают, что положение вставки определяет уровень экспрессии добавленного гена и что добавленный ген стабильно сохраняется во всех положениях генома. Кроме того, только вставка дополнительного гена между соединением N и P приводила к значительному снижению потенциала репликации вируса; вставка во все другие соединения не оказала заметного влияния на репликацию в анализе одностадийного роста.

После пассажа вирус NIP восстановил репликацию до уровня дикого типа в течение двух пассажей.Одновременно с этим дважды пассированный вирус NIP-P2 утратил экспрессию встроенного гена в виде моноцистронной мРНК. Вместо этого он экспрессировался как нижняя половина бицистронной сквозной РНК. Сквозные РНК продуцируются, когда вирусная полимераза не может терминироваться на стыке генов выше по течению. Когда это происходит, транскрипция нижестоящего гена как дискретной моноцистронной мРНК ингибируется, так как нижестоящая инициация требует терминации выше по течению (6). Это, в свою очередь, приводит к потере шага аттенуации и усилению экспрессии всех нижестоящих генов.Анализ последовательности соединений вирусных генов, которые предшествовали и следовали за вставленным геном, а также следующего соединения ниже по течению (соединения генов NI, IP и PM), показал, что в то время как последовательность на конце гена I оставалась дикого типа, последовательность на конце конец гена N, предшествующий встроенному гену, быстро накапливал мутации. Наблюдалось несколько типов мутаций. Наиболее часто наблюдаемые мутации либо прерывали тракт U7 на конце гена, либо укорачивали его на 1 нт. Третьим типом возникшей мутации было изменение концевого тетрануклеотида гена, AUAC.В предыдущей работе с использованием субгеномных репликонов было показано, что мутации, которые либо укорачивали U-тракт, либо прерывали его, отменяли терминацию транскрипции, а изменение любого из четырех нуклеотидов тетрануклеотида снижало эффективность терминации (5). Накопление мутаций на конце гена N вируса NIP-P2 коррелирует с потерей терминации на конце гена N и с потерей экспрессии встроенного гена в виде моноцистронной мРНК. Эти данные обеспечивают поразительное прямое генетическое подтверждение посредством естественного отбора в вирусных популяциях предыдущих мутагенных анализов роли отдельных нуклеотидов в терминации (5, 6, 13, 29).Межгенный динуклеотид N-I и стартовая последовательность гена I не накапливают изменений. Кроме того, последовательность соединений генов I-P и PM, следующих за вставкой, не накапливала мутаций. Эти результаты обеспечивают внутренний контроль того, что наблюдаемые мутации на конце гена N не были артефактами ОТ-ПЦР, использованной при анализе восстановленных геномов. Они также предполагают, что межгенные соединения по своей природе не подвержены ошибкам. Причина нестабильности экспрессии вставленного гена между генами N и P может быть связана с нарушением репликации, вызванным нарушением молярного отношения белка N к P-белок и влияние этого соотношения на эффективную репликацию генома (12, 21).Репликация генома требует постоянного снабжения растворимым белком N для капсидирования зарождающихся реплицирующихся РНК (20). Предыдущая работа показала, что изменение молярного соотношения белков N и P влияет на уровни функционального белка N, поскольку белок P служит шапероном, предотвращающим самоагрегацию N и превращение его в нефункциональное в репликации (12). В качестве альтернативы, изменение относительных молярных соотношений других белков, которые должны взаимодействовать, также может иметь решающее значение. Предыдущая работа, в которой порядок трех центральных генов VSV был изменен для всех возможных перестановок, не приводила к репликативным недостаткам в каждом случае, когда были нарушены отношения N и P.В частности, вирус, имеющий порядок генов 3′-N, G, M, P, L-5′, реплицировался так же, как вирус дикого типа в клеточной культуре, что указывает на то, что существует множество сложных взаимодействий, которые еще предстоит понять. Данные представленные здесь показывают, что вставка дополнительного гена в любом из соединений генов приводила к подавлению экспрессии всех вирусных белков ниже вставки (таблица 2). Это произошло из-за дополнительной стадии аттенуации, вызванной транскрипцией добавленного гена. В то время как репликация всех вирусов, имеющих вставку на стыке генов PM, MG или GL, была сравнима с репликацией вируса дикого типа без вставки, репликация вируса NIP-P0, который имел молярное количество белка P уменьшился более чем на 30%, уменьшился на порядок, что указывает на то, что он воспроизводится в невыгодном положении.Вирус NIP-P2, который имел уровни репликации дикого типа, имел примерно такие же относительные количества всех вирусных белков, как и дикий тип, и, в частности, молярное соотношение белков N/P. Таким образом, мутации на конце гена N, которые ингибировали терминацию транскрипции и, как следствие, продуцировали сквозную РНК, устраняли дополнительную стадию аттенуации и восстанавливали экспрессию нижестоящих генов до уровня, близкого к уровню дикого типа. Напротив, PIM, MIG и Вирусы GIL сохраняли экспрессию вставленного гена в течение не менее 10 пассажей.Этот вывод аналогичен предыдущим сообщениям, которые показали, что экспрессия гена CAT или CD4 между генами G и L VSV оставалась стабильной в течение как минимум 15 или 26 пассажей соответственно (22, 24). Однако VSV, экспрессирующий ген белка слияния вируса кори (F) между G и L, потерял экспрессию гена F после трех пассажей (22). Было неясно почему, но авторы предположили, что белок F токсичен для роста VSV. Потеря экспрессии F коррелирует с накоплением мутаций на конце предыдущего гена и прочтением полимеразы, как описано здесь.Это привело авторов к предположению, что последовательность остановки транскрипции может быть горячей точкой для мутации. Однако наш анализ последовательностей трех таких сигналов показал, что концевые мутации гена накапливаются только там, где они подавляют экспрессию вставленного гена. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что конец гена не является горячей точкой мутации, но вместо этого в случаях, когда транскрипция добавленного гена создает неудобства для репликации вируса, будет быстро выбран наиболее эффективный способ подавления экспрессии дополнительного гена. .В NNS-вирусах, где транскрипция является обязательно последовательной, эффективная терминация каждого гена является ключом к последующей экспрессии генов. Для оптимальной терминации VSV требуется последовательность дикого типа в 12 нуклеотидах, содержащая конец гена и первый нуклеотид межгенного соединения, и изменение любого из этих нуклеотидов может уменьшить или отменить эффективную терминацию. Известно, что РНК-зависимая РНК-полимераза VSV имеет высокую частоту полимеразных ошибок приблизительно от 10 -3 до 10 -4 неправильных включений на нуклеотид на раунд копирования (25-27).Эта частота ошибок в сочетании с отсутствием механизма корректуры приводит к тому, что эти вирусы существуют в форме квазивидов (11). Восстановление вируса из клона кДНК представляет собой строгое мероприятие по клонированию, но не более чем биологическое клонирование путем сбора одной бляшки, которая является продуктом потомства одной вирусной частицы. К тому времени, когда вирус размножится до титров 10 8 БОЕ на мл, можно ожидать, что он будет существовать как квазивид. Сконструированные вирусы, извлеченные из кДНК, амплифицируются во много миллионов раз к тому времени, когда их пассируют два-четыре раза.Таким образом, они, скорее всего, являются квазивидами, у которых существует множество мутаций из-за событий полимеразной ошибки. Мутации, дающие преимущество вирусу, могут быть легко отобраны (11, 18, 19).

Последовательность дикого типа представляла собой преобладающую последовательность на стыке NI вируса, обнаруженного в первом большом пассаже, NIP-P0, как показал массовый анализ последовательности продукта ПЦР и что подтверждается тем фактом, что моноцистронная I мРНК была обильно синтезируется из этой вирусной популяции.Однако после двух пассажей экспрессия моноцистронной мРНК практически полностью подавлялась, а результаты анализа последовательностей отдельных клонов, полученных в результате независимых амплификации генома методом ОТ-ПЦР, соответствовали квазивидам вируса, у которых большинство вирусы в популяции представляли собой вирусы, имевшие селективное преимущество в отношении репликации благодаря мутациям, исключающим терминацию на конце гена N и, таким образом, экспрессию моноцистронной I мРНК.Эти изменения коррелируют с элиминацией события аттенуации, специфичного для соединения, и восстановлением молярных соотношений белков и репликации вируса до уровней дикого типа. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что в пределах одного промотора транскрипции и обязательной последовательной транскрипции выбор последовательностей, которые изменяют эффективность терминации вышестоящего гена, является эффективным средством, с помощью которого экспрессия нижестоящего гена может быть подавлена ​​или уменьшена в РНК-вирусы NNS.

Представленные здесь результаты имеют важное значение для использования вирусов NNS в качестве векторов и вакцин. С положительной стороны они показывают, что уровень экспрессии гетерологичного гена может контролироваться расположением гена относительно 3′-промотора. Однако они также предупреждают, что не все положения в геноме обеспечивают стабильную экспрессию чужеродного гена.

Наконец, хотя вирусы, имеющие вставки в соединениях PM, MG и GL, реплицировались так же, как и вирусы дикого типа без вставок на одностадийной кривой роста, будет интересно определить приспособленность этих вирусов к сравнению с вирусом дикого типа.Также будет важно определить, является ли размер вставленной транскрипционной единицы, а также добавление другого соединения генов с сопутствующим этапом аттенуации селективным недостатком вируса.

РИС. 1.

РИС. 1. Вставка и экспрессия дополнительной идентичной транскрипционной единицы в одном из соединений каждого гена VSV. (A) Схематическое изображение положения вставки 661-нуклеотидной некодирующей единицы транскрипции на каждом из четырех соединений гена VSV.Извлеченные сконструированные вирусы, несущие дополнительный ген, были названы в соответствии с положением, в котором был добавлен вставленный ген I: NIP, PIM, MIG и GIL. (B) Синтез РНК, направленный вирусами NIP, PIM, MIG и GIL и вирусом дикого типа, выделенным из родительского клона кДНК без дополнительного гена. РНК, специфичную для ВВС, метили [ 3 H]уридином в присутствии актиномицина D в течение 2 ч, начиная с 1,5 ч после инфицирования, и анализировали с помощью гель-электрофореза. Положения геномной РНК, пяти мРНК VSV и мРНК из вставленного гена I указаны слева от рисунка.мРНК P и M мигрировали вместе. (C) Молярные количества мРНК I, экспрессируемой из разных положений генома. РНК количественно определяли денситометрическим анализом авторадиограмм и рассчитывали молярные количества по отношению к экспрессии N мРНК.

РИС. 2.

РИС. 2. Репликация вирусов с дополнительным геном, вставленным в одно из соединений каждого гена VSV. Вирусы со встроенным дополнительным геном анализировали на потенциал репликации по сравнению с вирусом дикого типа путем одностадийного роста в клетках BHK-21, инфицированных при множественности 3 БОЕ.Весь вирус из P0 и P2 был проанализирован. Для простоты результаты показаны для NIP-P0, NIP-P2, PIM-P2, MIG-P2 и GIL-P2. Уровни репликации вирусов PIM, MIG и GIL были практически неразличимы на P0 и P2. Урожайность на клетку через 24 ч после заражения показана на вставке.

РИС. 3.

РИС. 3. Синтез РНК, направляемый вирусами, имеющими дополнительный ген, встроенный в каждое из соединений вирусных генов после двух дополнительных пассажей. (A) Сравнение синтеза РНК, направленного вирусами NIP-P2, PIM-P2, MIG-P2, GIL-P2 и дикого типа.РНК метили [ 3 H]уридином в присутствии актиномицина D (как описано в подписи к рис. 1) и анализировали методом гель-электрофореза. (B) Анализ идентичности РНК NI (указана стрелкой) путем отжига олигонуклеотидов с отрицательным смыслом, специфичных для последовательности мРНК N или I, или олигонуклеотида с положительным смыслом, специфичных для гена L, с РНК от инфекции с NIP-P2 помечен, как на панели А, с последующей инкубацией в присутствии (+) или в отсутствие (-) РНКазы Н и гель-электрофореза.

РИС. 4.

РИС. 4. Анализ последовательности соединений генов, фланкирующих встроенный ген. (A) Консервативная последовательность соединения генов VSV и ее связь с мРНК потомства. (Б) Схема положения праймеров, использованных для ОТ-ПЦР-анализа геномов исходного вируса и вируса Р2. (C) Анализ последовательности объемных продуктов ПЦР геномной РНК NIP-P2.

ТАБЛИЦА 1.

ТАБЛИЦА 1. Последовательности межгенных соединений 35 клонов кДНК вируса NIP-P2Клонов с указанными изменениями на IG Junction
I-P P-M 3 ‘ 3′ 3 ‘ 3 . АУАКУУУУУУГАУУГУК. . 5 ‘ 4 33 33 34 WT U 6 . . АУАКУУУУУУГАУУГУК. . 3 1 1 1 U 8 ▴ 6 .. АУАК.УУУУУУГАУУГУК. . 11 0 0 U 6 . . АУАКУУУУУУГАУУГУК. . 13 1 0 U 2 CU 4 . . АУАКУУУУКУУГАУУГУК. . 1 0 0 U 4 CU 2 . . АУ..УУУУУУГАУУГУК. . 1 0 0 АС.. . . АКАКУУУУУУГАУГУК. . 2 0 0 ACAC

a

IG, межгенные WT, дикий тип.

Таблица 2.

Таблица 2

. Н Р М G L NIP-Р0 100 64 62 43 61 NIP-Р2 100 94 90 90 80 86 86 100 100+ 62 48 61 MIG-P2 100 100+ 100 + 61 61 61 7 GIL-P2 100 100+ 100+ 100+ 57

A 9 0022

Молярные соотношения отдельных белков VSV рассчитывали по отношению к белку N и выражали в процентах от молярного соотношения белков вируса дикого типа без добавленного гена.вес, дикий тип.

Благодарности

Мы благодарим Xiaoling Tang за отличную техническую помощь и наших коллег за конструктивные комментарии.

Эта работа была поддержана грантами Службы общественного здравоохранения от NIAID (R37 AI 12464 для GWW и AI 18270 для LAB).

Ангулярный стоматит и статус рибофлавина

Резюме опубликованной статьи

1

Тяжелый ангулярный стоматит

В период с 1990 по 1993 год из-за страха перед преследованием 83 000 этнических непальцев бежали из Бутана в лагеря беженцев в Непале.В период с декабря 1998 г. по март 1999 г. количество зарегистрированных случаев ангулярного стоматита (истончение или трещины в углах рта) увеличилось в шесть раз, с 5,5 до 35,6 случаев на 1000 человек в месяц. Самые высокие показатели выявлены у детей и подростков. Это увеличение последовало за исключением обогащенных хлопьев из пищевых рационов в январе 1999 года из-за программных ограничений. Следовательно, содержание рибофлавина в дневном рационе снизилось с менее чем 0,6 мг/день до 0,4 мг/день, что значительно ниже рекомендуемого ВОЗ количества 1.35-1,8 мг/сут для подростков.

Легкая/умеренная ангулярный стоматит

Ангулярный стоматит (АС) классически связывают с дефицитом рибофлавина, других витаминов группы В и железа. Потенциальные функциональные последствия дефицита рибофлавина у людей включают снижение двигательных навыков и концентрации внимания, а также снижение всасывания или использования железа.

В октябре 1999 года 463 беженца-подростка были случайным образом обследованы для оценки распространенности АС и распространенности низких концентраций рибофлавина, фолиевой кислоты, витамина B-12 и железа.Были проведены опросы и физические осмотры, взяты образцы крови. Биохимические показатели использовались для определения того, связан ли статус рибофлавина с АС, и для оценки потенциала использования АС в качестве меры скрининга низких концентраций рибофлавина. Рибофлавиновый статус оценивали по коэффициенту активности эритроцитарной глутатионредуктазы (EGR) (EGR — рибофлавинзависимый фермент).

Основными выводами исследования были распространенность АС (26,8%), высокая распространенность низкой концентрации рибофлавина (85,8%).8%), а статус рибофлавина был связан с АС. У подростков с АС концентрация рибофлавина была значительно ниже, чем у подростков без АС.

Рубцово-ангулярный стоматит

Авторы исследования пришли к выводу, что AS является хорошей мерой скрининга низкой концентрации рибофлавина. Он имел высокую специфичность и положительную прогностическую ценность (PPV), но низкую чувствительность при обнаружении низкой концентрации рибофлавина. Поскольку PPV увеличивается с распространенностью заболевания, можно было бы ожидать, что PPV будет ниже там, где распространенность АС ниже.Высокий PPV в этом обзоре (89%) показывает, что AS можно использовать в сочетании с другими соответствующими данными о питательных веществах, например. данные о составе питательных веществ в продовольственной корзине в качестве инструмента наблюдения для выявления предельных концентраций рибофлавина у беженцев или перемещенных лиц. Однако низкая чувствительность АС ограничивает его применение в качестве индивидуального скрининга низких концентраций рибофлавина.

Показать сноски

Больше похоже на это

FEX: Окружность середины плеча как скрининговый инструмент для выявления подростков с худобой

Посмотреть эту статью в формате pdf Снимок исследования1 Подростковый возраст является уникальным периодом быстрого роста и, в сочетании с отсутствием продовольственной безопасности в семье, также является периодом упадка сил…

FEX: Микронутриенты в порошках и железо-фолиевая кислота в таблетках для контроля анемии у беременных

Резюме исследования2 Основной причиной анемии беременных является дефицит железа, что можно предотвратить. Подсчитано, что 56% беременных женщин в развивающихся странах…

FEX: Текущие данные об анемии и стратегиях приема питательных микроэлементов у детей школьного возраста и подростков

Посмотреть эту статью в формате pdf Lisez cet article en français ici Елена Хемлер, Вафаи Фавзи и Стефани Роттсли Елена Хемлер — старший координатор проекта…

FEX: Биодоступность каротиноидов железа, цинка и провитамина А в биообогащенных основных культурах

Резюме исследования1 Местоположение: глобальный Что мы знаем: Биообогащение основных продуктов питания является одним из возможных способов увеличения потребления микронутриентов населением с ограниченными ресурсами….

FEX: Матери понимают и могут это делать (MUAC)

Резюме исследования2 Местонахождение: Нигер Что мы знаем: Управление SAM на уровне сообщества часто зависит от антропометрического скрининга, проводимого местными работниками здравоохранения.Обучение включает…

FEX: Взаимодействие между питанием и иммунной функцией: использование биомаркеров воспаления для интерпретации статуса микронутриентов

Резюме исследования2 Местоположение: глобальный Что мы знаем: как клиническое, так и субклиническое воспаление влияет на концентрацию многих питательных веществ в плазме. Это усложняет оценку…

FEX: Эпидемия пеллагры в Куито, Ангола

Софи Баке и Мишель ван Херп Софи Баке — диетолог из штаб-квартиры MSF в Бельгии, а Мишель ван Херп — эпидемиолог из штаб-квартиры MSF в Бельгии.Это…

FEX: на пути к запоздалой ликвидации эпидемий авитаминозов

Андре Бриан Андре Бриан — врач, работающий во Французском государственном исследовательском институте Institut de Recherche pour le Développement (IRD), которому поручено…

en-net: Протоколы скрининга и лечения анемии среди девочек-подростков

В Джаркханде, Индия, более 70-90% девочек-подростков страдают анемией. Государство предоставляет один раз в неделю в школах добавку IFA для профилактики анемии среди девочек-подростков.Последний…

FEX: дефицит ниацина и пеллагра в Анголе

Резюме опубликованных исследований 1 Признаки пеллагры, наблюдаемые при обследовании Недавнее исследование, инициированное организацией World Food Программа (ВПП) совместно с правительство…

FEX: больше доказательств в пользу железных горшков

Опубликованная статья Эфиопия — лагерь беженцев Димма, демонстрация энергосберегающей плиты. В Field Exchange 5 мы опубликовали резюме исследования, проведенного в Бразилии, которое показало…

FEX: Дефицит железа и витамина А у африканских беженцев

Резюме опубликованных исследований2 Исследование Haemacue в Танзании В лагерях беженцев на севере и востоке Африки в период с 2000 по 2002 год было проведено пять перекрестных исследований для оценки…

FEX: Приемлемость и удобство использования неинвазивного монитора гемоглобина членами сообщества и работниками здравоохранения в Танзании

Ребекка Смит, д-р Асрат Дибаба, Абена Томас, Мвивано Малимбви, д-р Фрэнк Мтимбва и д-р Нельсон Букуру Ребекка Смит — координатор по исследованиям и публикациям Enhancing…

FEX: Вмешательства, не связанные с питанием, для профилактики анемии у детей школьного возраста и подростков

Посмотреть эту статью в формате pdf Lisez cet article en français ici Натали Рошник, Эндрю Холл, Мусса Сако и Сиан Кларк Натали Рошник, старший специалист по питанию…

en-net: Публикации по мгновенному нагреву грудного молока

Меня очень интересует литература о мгновенном нагреве грудного молока в контексте ВИЧ. Есть ли публикации об эффективности и действенности этого…

FEX: Воспаление и умеренная острая недостаточность питания у детей: перекрестное исследование в Буркина-Фасо

Резюме тезисов конференции1 Представлено на исследовательской конференции ACF, 9 ноября 2016 г. Опубликованное исследование: B Cichon, F Fabiansen, CW Yaméogo, MJH Rytter, C Ritz, A…

FEX: Международное отделение экстренной помощи и здравоохранения беженцев в CDC

Имя Международное отделение здравоохранения по чрезвычайным ситуациям и беженцам (IERHB), CDC Адрес 4770 Buford Highway, Атланта, Джорджия…

FEX: Обогащенная кукурузная мука улучшает статус витамина А и железа у беженцев

Резюме опубликованных полевых испытаний1 Предварительное смешивание на лагерь беженцев Лагерь беженцев Нангвеши был открыт в 2000 году в связи с наплывом беженцев, спасающихся от гражданской войны в Анголе…

FEX: Режим питания и состояние питания детей школьного возраста и подростков в Танзании

Посмотреть эту статью в формате pdf Саули Джон, Джеффри Мчау, Хевенлайт Аюбу, Станслаус Мафунг’а, Самафилан Айнан, Виггинс Кьятикила, Элизабет Лиимо, Фрэнк Чаки, Фатумата…

ru-net: Plumpy nut В сравнении с дополнительным пухлым

Основываясь на информации о питании двух продуктов, нет никакой разницы в питательном составе (энергия, белок, жир и микронутриенты), за исключением сливового ореха животного…

каннабиса: влияние на здоровье полости рта | Американская стоматологическая ассоциация

Каннабис — это род однолетних цветковых растений, произрастающих в умеренных зонах по всему миру, с долгой историей использования в промышленных, рекреационных и медицинских целях. 1 Растение Cannabis sativa действует как мягкое седативное средство и улучшает настроение для рекреационных пользователей и используется в клинических целях благодаря своим обезболивающим и противорвотным свойствам. 2-4 Высушенные листья растения каннабис можно курить как марихуану, которая является наиболее распространенной формой, которую в настоящее время употребляют 12% взрослых американцев, 5 по сравнению с 7% в 2013 году. 6 Доля количество пользователей резко увеличилось с начала 1970-х годов; в опросе 2017 года около 45% американцев заявили, что хотя бы пробовали марихуану. 7 Начиная с 2012 года некоторые штаты США начали легализовать это вещество для медицинского и/или рекреационного использования. 6, 8, 9 Несмотря на рост общественного и юридического признания каннабиса, проблемы общественного здравоохранения остаются.

Химический анализ каннабиса обнаруживает более 500 соединений, из которых более 120 являются каннабиноидами, классом химических веществ, которые непосредственно взаимодействуют с эндогенными каннабиноидными рецепторами нервной системы. 4, 10, 11 С нейротропной точки зрения тетрагидроканнабинол (ТГК) является наиболее важным из этих каннабиноидов, ответственным за его психоактивные эффекты.Концентрация ТГК определяет эффективность продукта каннабиса и сильно различается в разных препаратах и ​​внутри них; 2-4, 10, 12 Было замечено, что активность продуктов каннабиса в отношении ТГК со временем увеличивается. 13-15  ТГК обычно относится к наиболее активному изомеру дельта-9, хотя синтетически концентрированные формы дельта-8 ТГК становятся все более распространенными. 16

Высушенные листья и цветки растения каннабис обычно скручивают в сигареты («косяки» 10, 15 ) или помещают в воду («бонг» 15 ) или другую трубку и курят, или их смоляные или масляные формы (гашиш и гашишное масло соответственно) проглатывается или вдыхается.При курении марихуана обеспечивает среднюю концентрацию ТГК от 0,5% до 9,6%. 2, 12

Каннабис также можно испарить в процессе негорючего нагревания, при котором высвобождаются психоактивные соединения, такие как ТГК, которые вдыхаются потребителем. Несколько моделей испарителей, в том числе устройства размером с ручку и настольные устройства, используются для испарения травы каннабиса, воска или жидкости для электронных сигарет. 17  Первоначальные исследования показали, что вейпинг каннабиса становится все более популярным среди подростков, 18  и также может вызывать более сильные субъективные эффекты наркотиков и ухудшение когнитивных функций. 19

Другой метод введения каннабиса, известный как «втирание», использует концентрированное бутановое гашишное масло, которое быстро испаряется и вдыхается. 20  Втирание концентратом каннабиса является сильнодействующим способом введения с концентрацией ТГК в диапазоне от 66,4% до 75,5%. 11, 21 Практика нанесения мазков была указана в качестве причинного фактора в отчете об остром повреждении легких, имитирующем пневмонию, 22 , а также побочных явлениях, связанных с высокой концентрацией ТГК (например,г., нарушение трудоспособности, рвота). 23

Каннабис также можно смешивать с пищевыми продуктами, и многочисленные пищевые продукты, полученные из каннабиса, доступны для медицинских или рекреационных целей, особенно в штатах США, которые легализовали рекреационную марихуану. 24  Некоторые пищевые продукты содержат формы гашиша с концентрацией ТГК от 2% до 20%. 2, 10, 12 Потребление продуктов, содержащих каннабис или соединения, полученные из каннабиса (например, ТГК), связано с более медленным началом психоактивных эффектов, которые могут быть отсрочены на один-три часа. 10

Неврологические и поведенческие эффекты каннабиса включают чувство благополучия в сочетании с немедленными когнитивными и психомоторными нарушениями. 3, 4, 14, 19, 25  Частое употребление уже давно связано с хроническими системными последствиями для здоровья, включая зависимость 14, 15, 26  и нарушение развития мозга, 4, 26 только те, кто с наибольшей вероятностью попробует это лекарство, но также находятся в критическом периоде для развития мозга. 4, 14, 26, 27  Употребление каннабиса в подростковом возрасте также связано с неясной связью с психотическими расстройствами и обострением психотических симптомов, включая шизофренические эпизоды. 8, 14, 26, 28-30 , а также суицидальные мысли и поведение. 31, 32 Пренатальное воздействие каннабиса также было связано с детской психопатологией. 27, 33

Непосредственные сердечно-сосудистые эффекты каннабиса включают учащение пульса (тахикардию) и нарушение микроциркуляции, которые могут привести к ряду серьезных состояний, от инфаркта миокарда до инсульта, 34-36 и сосудистых окклюзионных заболеваний, называемых «каннабисный артериит». 4, 10, 15, 26, 37-40  Кроме того, есть сообщения о случаях внезапной сердечной смерти во время интоксикации, 4, 26, 38 плюс одно исследование, которое выявило повышенный риск повышения систолического артериального давления после употребления каннабиса. . 41

Каннабис содержит многие из тех же канцерогенов, что и табак, и хроническое курение марихуаны связано с такими же респираторными патологиями, как и курение табака, 2–4, 14, 25, 38, 42–44 , хотя одновременное употребление табака и марихуаны усложняет приписывание причинно-следственной связи каннабису.

Рецидивирующий афтозный стоматит в ревматологии

Введение

Афты (греч. aphtai, ожог) представляют собой язвенные поражения, локализующиеся на поверхности слизистой оболочки, где, в отличие от эрозии, нарушение непрерывности затрагивает всю эпителиальную выстилку и может поражать подлежащую соединительную ткань.

Афтоз проявляется язвенными поражениями полости рта (афтами), которые часто болезненны и проходят самостоятельно. Причины возникновения язв в полости рта разнообразны: инфекционные заболевания кожи, рак, гематологические заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта, ревматические заболевания, лекарственные препараты и лучевая терапия (табл. 1).1–4 Они появляются почти всегда в неороговевающих областях рта на слизистой оболочке (внутренняя сторона щек, внутренняя поверхность губ, мягкое небо, вентральная часть языка и дно рта), но не являются исключением и на ороговевшей поверхности. которая составляет жевательную слизистую оболочку (десны и твердое небо) или даже специализированную слизистую оболочку, расположенную в эпителии спинки языка. Они считаются острыми, если длятся менее шести недель, или хроническими, если длятся дольше. Когда они проявляются в виде рецидивирующих оральных вспышек при отсутствии системной причины, их называют рецидивирующим афтозом полости рта (РОА) или рецидивирующим афтозным стоматитом.

Эпидемиология

РОА является одним из наиболее распространенных заболеваний полости рта, распространенность которого варьирует в исследуемых популяциях5, но примерно 20% населения в целом страдает в какой-то момент своей жизни. Имеет семейную агрегацию и чаще встречается у женщин. Обычно она начинается в детстве, подростковом возрасте или у молодых людей до 30 лет, с тенденцией к уменьшению со временем как тяжести, так и частоты.6

Патогенез

Этиология и патогенез ROA до сих пор неизвестны.Вполне вероятно, что у генетически предрасположенных лиц иммунная дисфункция, связанная с различными триггерами, способствует развитию афтоза. Местная иммунологическая дисфункция может быть связана с увеличением субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4 и CD8) и играет важную роль в измененных иммунных реакциях, при которых первоначальный стимул неизвестен. Также были описаны изменения уровней иммуноглобулинов в сыворотке, которые могут играть роль в патогенезе язв, и сообщалось об изменениях в молекулах клеточной адгезии, которые необходимы для поддержания стабильной структуры орального эпителия.7–11

Причастны возможные местные и общие факторы, которые могут способствовать развитию или ухудшению язв12:

  • 1.

    Генетический. Существует семейная агрегация, и некоторые исследования коррелируют ROA с антигенами HLA13–15. Вероятность развития афтозных поражений составляет 90 % у людей, у которых есть два родителя, и снижается до 20 % у тех, у кого родители никогда их не имели.16

  • 2.

    иммунодефицит.17

  • 3.

    Инфекции, вероятно, мало что значат. Имеются данные о возможной перекрестной реактивности между бактериальными антигенами и слизистой оболочкой полости рта. Были замечены потенциальные ассоциации с инфекцией Helicobacter pylori18, а также вирусом герпеса человека-619.

  • 4.

    Механические травмы20 (укусы, зубные протезы, зубные щетки и др.), термические или химические поражения. РА была связана с местным раздражающим действием лаурилсульфата натрия, поверхностно-активного вещества, используемого во многих типах зубных паст, которые могут влиять на людей с РА.21

  • 5.

    Отказ от курения. У некурящих снижается ороговение слизистой оболочки, которая, тем не менее, более чувствительна при наличии поражений; при курении нет влияния на их выраженность.22

  • 6.

    Дефицит витаминов и минералов, таких как железо, фолиевая кислота и витамин В12 у больных с частой РОА, без достоверных различий при изучении каждого элемента в отдельности.23 В других исследованиях существует значительная связь с дефицитом витаминов А и В1224 и В125.

  • 7.

    Гиперчувствительность к пищевым продуктам (шоколад, сыр, цитрусовые, помидоры, морепродукты и др.) с историей атопии28.

  • 8.

    Гормональные изменения. РОА часто связывают с менструальным циклом, но эта связь четко не установлена.29

  • 9.

    Стресс. Он может играть роль триггерного или модифицирующего фактора, а не вызывать ROA.30,31

Клинические проявления

Поражения инициируются очагами воспаления в виде болезненных эритематозных пятен. В течение нескольких часов кератолиз, опосредованный цитокинами, приводит к неглубокой, округлой или овальной, четко очерченной язве с приподнятым воспалительным ореолом, в котором под микроскопом можно наблюдать большое количество нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. Центр некротизирован и покрыт желтовато-серой псевдомембраной (рис. 1). Они представляют собой центробежный рост, а заживление достигается за счет повторной эпителизации краев.

Их присутствие может мешать речи, приему пищи и глотанию. Боль подобна ожоговой и усиливается при контакте с горячей пищей и специями.

Существуют три различные формы проявления язв при РОА: малая, большая и герпетиформная.32

  • Малый афтоз является наиболее распространенным. Обычно поражает неороговевающую слизистую оболочку, особенно губы, щеки и боковые части языка. Для него характерны одиночные или несколько язв (менее 5) размером менее 1 см.Они обычно концентрируются в передней части рта и часто возникают 2–4 раза в год. Они представляют собой спонтанное заживление без рубцов в течение 1-2 недель.

  • Большой афтоз встречается реже. Обычно поражает ороговевшие и неороговевающие слизистые оболочки, особенно мягкое небо. Протекает в виде одиночных или нескольких язв (менее 5) размером, равным или превышающим 1 см. Обычно они имеют пристрастие к задней части рта. Они более глубокие и болезненные, чем мелкие афты.Чтобы зажить и оставить шрам, требуется 2–12 недель.

  • Герпетиформный афтоз встречается реже всего. Обычно поражает неороговевающую слизистую оболочку, особенно дно полости рта и вентральную поверхность языка. Обычно имеет более позднее начало, чем две предыдущие формы, на втором или третьем десятилетии жизни. Проявляется вариабельным количеством язв (10–100) размером 1–3 мм, которые появляются одновременно и могут сливаться. Для заживления требуется 1–4 недели, после чего могут остаться шрамы, особенно на сливающихся язвах.

Дифференциальный диагноз

Наличие афт во рту помогает в дифференциальной диагностике. В соответствии с ним диагноз может быть поставлен в зависимости от того, является ли это одиночной язвой, рецидивирующими эпизодами одной или нескольких язв, которые спонтанно заживают, единичным эпизодом, которому предшествуют волдыри, язвами, поражающими несколько участков полости рта, или персистирующим афтозом полости рта, поражающим разные участки (табл. 2).32 При появлении рецидивирующих эпизодов одной или нескольких язв, которые заживают спонтанно, необходимо провести дифференциальную диагностику между рецидивирующим афтозным стоматитом, болезнью Бехчета, афтозоподобными язвами, вызванными системными заболеваниями или лекарствами, и рецидивирующей многоформной эритемой.

В дополнение к представлению афт полости рта, тяжесть клинических проявлений афтоза полости рта также помогает в дифференциальной диагностике. По этому критерию они классифицируются как простой афтоз и афтозный комплекс (рис. 2).33–36 Простая форма афтоза встречается чаще. с 3-6 эпизодами в год, которые имеют короткую продолжительность и разрешаются спонтанно, что позволяет диагностировать РОА.Афтозный комплекс проявляется длительными вспышками, которые часто носят непрерывный характер, с тремя и более очагами в полости рта и могут быть связаны с генитальными или перианальными язвами.

Столкнувшись со сложным афтозом полости рта, первым делом необходимо исключить болезнь Бехчета. После исключения диагноза комплекс афтоза полости рта можно классифицировать как первичный или вторичный.

Для установления диагноза первичного сложного афтоза необходимо отбросить все процессы, которые могут продуцировать и которые классифицировали бы его как вторичный (табл. 3),35 но даже в этом случае следует отметить, что диагностика болезни Бехчета может быть затруднена на ранних стадиях и может затягиваться до нескольких лет, что обосновывает тщательное диспансерное наблюдение за всеми больными, у которых диагностирован сложный первичный афтоз.37

Вторичный комплексный афтоз полости рта может быть признаком многих системных процессов, которые могут проявляться эпизодами, подобными рецидивирующему афтозу полости рта. Наиболее распространенным является воспалительное заболевание кишечника, которое может быть его первым проявлением.

В клинической ревматологической практике нередко встречаются язвы, вторичные по отношению к некоторым лекарственным препаратам и некоторым заболеваниям с суставными проявлениями.

Что касается лекарственных средств, то в связи с ними зарегистрировано много случаев изъязвления полости рта, и среди них несколько широко используются в ревматологии, даже для лечения системных заболеваний, которые, в свою очередь, могут вызывать афтоз полости рта (табл. 4).38–42

Что касается системных заболеваний, которые могут поражать суставы (артрит или боль в суставах), некоторые из них включают наличие язв в число диагностических критериев:

  • 1.

    Красная волчанка: язвы в полости рта или носоглотки, обычно безболезненные , наблюдаемый врачом.43

  • 2.

    Болезнь Бехчета: рецидивирующие язвы в полости рта (большой, малый или герпетиформный афтоз), наблюдаемые врачом или пациентом и возникающие не менее трех раз в течение 12 месяцев.44

  • 3.

    Гранулематоз Вегенера: воспаление полости рта или носа с развитием болезненных или безболезненных язв в полости рта или гнойных или кровянистых выделений из носа. тракта, не обязательно с продольной организацией, в течение не менее трех месяцев, плюс казеозные гранулемы.46

  • 5.

    Синдром PFAPA («Периодическая лихорадка, афтозный стоматит, фарингит, шейный аденит»): язвы в полости рта.47

Другие системные заболевания, которые имеют или могут иметь поражение суставов и иногда проявляются язвами в полости рта, но их наличие не включено в диагностические критерии:

  • 1.

    Реактивный артрит может присутствовать и обычно не вызывает боли. 48

  • 2.

    Синдром Шегрена: сухость слизистой оболочки полости рта, часто присутствуют язвы.49

  • 3.

    Синдром Свита или острый нейтрофильный фебрильный дерматоз. обнаруженные в контрольной группе пациентов с функциональными нарушениями перистальтики кишечника,52 но более стойкие и имеют тенденцию к большему размеру.53

Другим синдромом, который можно учитывать при дифференциальной диагностике ревматических заболеваний, способных вызывать комплекс афтоза полости рта, является синдром MAGIC («язвы во рту и половых органах с воспаленным хрящом»), который не имеет установленных диагностических критериев, но проявляется совпадением синдрома Бехчета, при котором рецидивирующие язвы являются диагностическим критерием, и рецидивирующего полихондрита.54

Лечение

Отсутствие знаний о причине РОА делает невозможным лечение болезни.Существующие симптоматические методы лечения направлены на уменьшение боли, сокращение времени заживления язв и увеличение продолжительности бессимптомных периодов между приступами. Когда язвы небольшие, с небольшим количеством симптомов и редко, достаточно местного лечения наряду с диетическими мерами, такими как отказ от продуктов, которые могут ухудшить язвы, включая те, которые из-за их твердой текстуры могут разрушать слизистую оболочку полости рта. Если выявлены провоцирующие факторы, их можно скорректировать и воздействовать на них. При наличии основного процесса, объясняющего появление афтоза, лечение его приводит к улучшению состояния.

Систематический обзор результатов различных местных методов лечения, используемых при РА, позволил сделать следующие выводы относительно их способности снижать частоту возникновения язв и их анальгетическую силу55: образуя защитную пленку на дне язвы в полости рта, уменьшая боль и сокращая время заживления. Амлексанокс 5% также приводит к быстрому заживлению язв при применении в виде оральной мази.Использовалась криотерапия жидким азотом, но она не показала большего обезболивающего эффекта, чем плацебо.59 Также использовалось лазерное лечение60, как и ультразвук низкой интенсивности.61

успеха, в том числе: стероиды,62 пентоксифилин,63 левамизол,64 колхицин и дапсон,65 талидомид,66,67 биологический препарат,68 лечение,69 клофазимин,70 и другие (метотрексат, азатиоприн, циклоспорин, циклофосфамид и др.