Содержание

Воспаление слизистой оболочки полости рта: причины и лечение

Чем может быть вызвано воспаление слизистой оболочки полости рта и какое следует назначать лечение при нем, как правильно выявить причину воспаления полости рта – все это наверняка будет интересно тем, кто хотя бы раз сталкивался с данным недугом в силу тех или иных причин. Также мы расскажем, какие вредные привычки могут спровоцировать воспаление слизистой рта.

Виды воспалений слизистой оболочки рта

Воспаление слизистой оболочки полости рта является ключевым симптомом при таких заболеваниях, как:

Во всех данных заболеваниях симптомы будут одинаковыми: боль во рту, в районе десен, на губах, щеках или сильная боль в горле. Нередко воспаление полости рта сопровождается нагноениями, если его вовремя не начать лечить. В качестве лечения в легких случаях обычно применяют полоскание при помощи лечебных трав, чаи, применение антисептических растворов и реже – антибиотики, но их назначает лишь врач.

Воспаление слизистой оболочки во рту относится к группе стоматических болезней. Как правило, слизистая оболочка имеет свойство воспаляться на фоне тех или иных изменений в организме человека, на которые следует обратить внимание. Отдельными случаями при этом считаются травмы оболочки или ее ожоги, для лечения которых, если речь идет не о серьезных травмах, можно применять народные средства вроде тех же полосканий.

Почему воспаляется слизистая в полости рта: причины и лечение

Воспаление слизистой оболочки во рту — очень частое заболевание, с которым стоматологи сталкиваются практически ежедневно. Естественно, чтобы назначить больному корректное лечение, следует сперва определить причину такого воспаления. Наиболее частыми причинами воспаления в ротовой полости являются:

  • плохая гигиена ротовой полости;
  • запущенный кариес и его несвоевременное лечение;
  • наличие зубных камней;
  • неправильно сделанные протезы для зубов и другие причины.

Также слизистая оболочка во рту может воспаляться на фоне таких хронических заболеваний, как:

  • диабет;
  • патологические проблемы с желудком;
  • проблемы с иммунитетом;
  • гормональные нарушения;
  • табакокурение;
  • злоупотребление алкогольными напитками;
  • гормональные нарушения на фоне беременности и многое другое.

Естественно, когда к врачу на прием приходит больной, у которого воспалена слизистая во рту, врач обязан сделать подробный осмотр и опрос пациента на предмет выявления сопутствующих недугов, также берет анализы, пробы на аллергию, может при необходимости назначить осмотр у других врачей. И только после выяснения всех обстоятельство он назначает схему лечения, поскольку неправильное лечение может лишь усугубить как воспалительный процесс, так и общее состояние пациента.

Так, например, если воспаление слизистой оболочки началось из-за механического ее повреждения, то в качестве лечения подойдет лишь антисептическая обработка места травмы. Если же причиной воспалительного процесса стал ожог полости рта или обморожение, то к антисептикам добавляются препараты против воспаления и даже обезболивающие препараты, если воспаление сопровождается болевыми ощущениями.

Если причиной недуга стало взаимодействие ротовой полости с химически активным веществом, что часто бывает у детей, то рот следует немедленно промыть нейтрализующим средством, промывают его специальными ванночками, используют антисептические препараты и ставят обезболивающие аппликации на место повреждения слизистой.

Иное лечение будет тогда, когда воспалительный процесс был вызван инфекцией, которая появляется на фоне таких заболеваний, как:

  • герпес;
  • грипп;
  • скарлатина;
  • ветрянка и прочие заболевания.

В таких случаях лечение включает в себя общую терапию, включая прием иммуномодулирующих препаратов, антивирусных средств, витаминов и прочего, а также местное лечение.

Для лечения воспаления используют противогрибковые и антибактериальные препараты, если его причиной стал грибок Кандида или другие вредоносные микроорганизмы.

Иногда лечение включает в себя пломбирование или удаление зубов, если вследствие травмы или тяжелой формы появилась такая необходимость.

В случаях, когда причиной воспаления стала плохая гигиена ротовой полости, врач может назначить профессиональную чистку и провести урок гигиены для пациента. Если воспаление не слишком болезненное и не имеет тяжелую форму, то такая профилактическая мера будет вполне достаточной.

Если воспаление сопровождается появлением отеков или язвочек на слизистой оболочке, а также появляются боли при приеме пищи, то следует обратиться к врачу и начать лечение, иначе воспаление может стать хроническим и поразить легкие, бронхи и другие органы.

Почему травмируется слизистая?

Иногда человек может жаловаться на боль в области неба. Нередко такая боль возникает при травмировании слизистой оболочки во время употребления слишком горячих напитков вроде чая или кофе. Кожа на слизистой очень тонкая и ранимая, нередко ее целостность нарушается вследствие приема слишком твердой пищи. Боли, как правило, начинаются не сразу же, а через несколько дней. Так, в образовавшуюся ранку попадают вредоносные микробы и начинается воспалительный процесс. Чтобы этого не допустить, нужно в качестве лечения использовать масляный раствор витамина А и полоскать полость травяными настоями.

Нередко проблемы со слизистой могут возникнуть, если злоупотреблять цитрусовыми фруктами и даже семечками, если их разгрызать зубами, а не руками. Так, следует контролировать употребление кислых фруктов и других продуктов с «кислинкой». При поражениях слизистой ее следует обработать ретиноловой мазью или антисептиком тонким слоем.

Почему слизистая оболочка облезает?

Облезание слизистой оболочку во рту является одним из симптомов стоматита или же из-за проблем с неврологией. Наиболее распространенные причины этого явления следующие:

  • постоянные неврозы и стрессы, постоянная нагрузка на мозг, довольно часто встречается у студентов во время сессии, когда после ее сдачи они имеют проблемы по стоматологической части;
  • химический ожог слизистой, который может быть спровоцирован водкой или некачественным алкоголем в больших дозах;
  • ожог от горячей пищи;
  • заболевания желудочно-кишечного тракта, однако, они вызывают стоматиты крайне редко.

При проблемах с желудком оболочка начинает облезать совершенно неожиданно, поэтому следует немедленно обратиться к врачу, который по факту уже проведет обследование и назначит необходимую схему лечения.

При химических ожогах лечение можно ограничить применением регенерирующих средств, если они не слишком велики. А если же проблема в снижении иммунитета и нервах, следует начать прием иммуномодуляторов, витаминов и успокоительных препаратов. Также нельзя забывать и о полоскании и обработке полости специальными лекарственными и народными средствами.

Иммуномодулирующие препараты желательно при воспалительном процессе принимать независимо от причины, которая его спровоцировала, поскольку любое воспаление является следствием ослабления организма и его следует укреплять и восстанавливать.

Пирсинг и воспаление слизистой оболочки во рту: как они взаимосвязаны?

Иногда причиной воспалительного процесса во рту является пирсинг языка, который, хоть и крайне опасный и болезненный, но все же очень популярный среди молодых людей.

Дело в том, что перед данной процедурой следует провести санацию рта целиком, а также приготовить себя к данной операции хотя бы за неделю, попринимав комплекс витаминов и минералов.

Иногда во время данной процедуры может возникнуть глоссит или абсцесс, так организм пытается отторгнуть инородное тело, избежать этого можно при проведении предваряющих процедур. Однако такой пирсинг для слизистой – вещь крайне неприятная, поскольку даже если все заживет, случайные травмы полости при наличии пирсинга во рту – явление достаточно распространенное и стоматологи не рекомендуют ничего прокалывать во рту, чтобы не иметь проблем с инфекциями и всевозможными заболеваниями полости рта.

Особенности воспаления у курильщиков

Отдельно стоит рассказать о воспалении слизистой оболочки во рту у заядлых курильщиков. Как и у любителей пирсинга, у них есть выбор — желание выделиться или здоровье.

Дело в том, что, несмотря на всевозможные процедуры курящий человек не способен защитить себя от стоматита на все сто процентов, поскольку действие никотина намного сильнее, он способен убивать все полезные вещества, которые появляются в организме с теми же витаминами.

Естественно, что стоматиты у курильщиков встречаются гораздо чаще, нежели у некурящих и лечение воспаление будет просто бесполезным, если человек немедленно не откажется от этой вредной привычки. Лечение же заключается в полоскании и обработке повреждений специальными мазями.

При отказе от курения и лечении воспаление может быстро сойти на нет, а вот если человек продолжает курить, то воспалительный процесс может лишь усугубляться даже при лечении, поскольку у никотина есть свойство разъедать тонкий слой слизистой оболочки и нарушать ее защитные свойства.

Особенности стоматитов у диабетиков

На этой категории больных тоже следует остановиться подробно, поскольку при сахарном диабете слизистая в ротовой полости практически всегда воспалена, обезвожена и постоянно трескается.

Лечение воспалительного процесса на фоне диабета крайне сложное, необходимо с особой строгостью относиться к гигиене рта и постоянно обрабатывать ротовую полость лечебными средствами, в частности, Метрогилом дента, который делает оболочку более мягкой и увлажняет ее, что очень важно для диабетиков.

Профилактические меры с целью предотвращения любого вида воспаления во рту очень просты: нужно регулярно тщательно чистить зубы не только щеткой, но и нитью, чтобы избавить полость от бактерий и каждый раз полоскать рот после приема пищи.

Следует также внимательно следить за своим питанием, сделать выбор в пользу здоровой пищи и отказаться от приема еды, которая провоцирует желудочно-кишечные заболевания. Естественно, нужно отказаться от сигарет и свести к минимуму потребление алкогольных напитков. Не будет лишним и прием витаминов, а также средств для укрепления иммунной системы.

Оцените статью: Поделитесь с друзьями!

Зубная Фея — Стоматит. Классификация, клиника, лечение, профилактика

Воспалительный процесс на слизистой оболочке ротовой полости, сопровождающийся ее изъязвлением называется стоматитом. 

Принято считать, что это заболевания полиморфно, то есть в основе его возникновения лежит множество причин.

Оно может быть, как самостоятельным заболеванием, так и осложнением других патогенных процессов.

 Наиболее распространенными причинами развития стоматита признаны несоблюдение тщательной и полноценной гигиены ротовой полости, дисбактериоз, заболевания желудочно-кишечного тракта, болезни сердечно-сосудистой системы, сниженный иммунитет, аллергизация организма, нарушенный обмен веществ, длительная антибактериальная терапия. 

Классификация стоматитов

1. По причине возникновения:

• травматические, возникающие вследствие ожога слизистой или ее ранения;

• инфекционные, возникающие на фоне инфекции в организме;

• специфические, возникающие по особым причинам: сифилис, туберкулез, отравления и прием лекарств;

• стоматологические, возникающие вследствие некачественно оказанной стоматологической помощи или от воздействия химических веществ, используемых при стоматологических манипуляциях.

2. По клиническим проявлениям:

• катаральная форма стоматита;

• язвенные стоматиты;

• афтозные стоматиты.

Клиника стоматита

Катаральная форма стоматита характеризуется поверхностным поражением слизистой оболочки ротовой полости с формированием ее отека. Пациент при возникновении данной стадии заболевания предъявляет жалобы на ощущение дискомфорта, болезненности в ротовой полости, повышенную чувствительность слизистой, гиперсолевацию (повышенное выделение слюны).

Язвенный стоматит характеризуется поражением всей толщи слизистого слоя. Данная форма стоматита сопровождается повышением температуры тела и соответствующими интоксикации симптомами: слабость, недомогание, головная боль. Помимо температуры отмечается увеличение и болезненность региональных лимфоузлов. Слизистая оболочка полости рта воспалена и отвечает на прием пищи сильной болью.

Афтозный стоматит представляет собой самую тяжелую форму стоматита, характеризующуюся образованием на слизистой оболочке плоских сероватых овальной или округлой формы с четкими границами язвочек, называемых афтами. Сопровождающими симптомами являются: недомогание, повышение температуры, болезненные ощущения. Данная форма стоматита отличается длительной продолжительностью и сложностью лечения.

Лечение стоматита

Терапевтическая стратегия должна основываться на стадии, в которой находится заболевание. Катаральная форма заболевания предполагает проведение санации ротовой полости, обработки слизистой дезинфицирующими растворами: раствором хлоргексидина, аминокапроновой кислоты, отваром ромашки, календулы, а также применения щадящей диеты, исключающей пищу, раздражающую слизистую ротовой полости. Язвенный и афтозный стоматит требуют применения антисептических растворов (стоматидин, мирамистин), анальгезирующих аэрозолей (триметазол, пропосол), аппликаций с масляными растворами витаминов А и Е, облепиховым маслом для ускорения регенерационных процессов. Помимо местной терапии назначают общее лечение, направленное на аннулирование причины, вызвавшей заболевание и повышение иммунных сил организма посредством приема поливитаминов.

Профилактика стоматита

Полноценная гигиена полости рта, своевременное устранение очагов хронической инфекции в организме, сбалансированное питание, здоровый образ жизни, умеренный подход к применению лекарственных средств, повышение иммунитета.

Воспаление слизистой оболочки полости рта, лечение

Почему воспаляется полость рта? Чем лечить воспаление слизистой оболочки полости рта и языка, какое лечение наиболее эффективное? Ответы на эти вопросы интересны тем, кто когда-нибудь перенес подобный недуг. В этой статье мы подробно расскажем также о причинах стоматита.

Какие причины стоматита бывают

Воспаление служит основным признаком герпетической инфекции, травматизации, гингивита, грибковых поражений, аллергических заболеваний. При этом симптомы патологии будут всегда одинаковыми.

Пациенты жалуются на болезненность в ротовой полости, деснах, губах, горле. У них возникает отек, воспаление десен и раздражение слизистой оболочки рта, губ, и лечение требуется  неотложное. Часто у больных образуются гнойники, особенно если своевременно не приступить к лечению. В легкой стадии больным показано полоскание травами, антисептиками, иногда антибиотиками по назначению доктора.

При легкой стадии воспаления больным показано полоскание рта

Воспаление еще называют стоматитом. Оболочки поражаются из-за определенных процессов в организме, на которые нужно обязательно обращать внимание. отдельно стоит обсудить поражения физического характера, ожоги.

Воспаление в ротовой полости – это не такое уж редкое явление. Стоматологи сталкиваются с ним практически каждый день. Для того, чтобы прописать пациенту эффективное лечение, важно сначала разобраться в причине заболевания. Самые распространенные из них:

  • несоблюдение гигиенических норм;
  • кариес и его неправильное лечение;
  • зубные камни;
  • неверно подобранные зубные капы.

Лечение воспаленной слизистой рта

Когда к специалисту на консультацию пришел человек с данной проблемой, ему необходимо провести качественное обследование на наличие разных патологий, доктор проводит исследование, делает аллергические пробы, назначает осмотр у других специалистов.

При воспалении полости рта следует обращаться в врачу стоматологу

Если слизистая рта воспалена, лечение  специалист прописывает по наиболее эффективной схеме индивидуально, так как неверно подобранные действия могут значительно усугубить ситуацию.

К примеру, если болезнь была вызвана механическим воздействием, применяют обработку антисептиками. Если всему виной ожог, то к основному лечению добавляют анальгетики для утоления боли.

Если болезнь возникла в результате контакта слизистой с химическими компонентами, рот обязательно прополаскивают при помощи нейтрализующих средств, используют специальные приспособления, антисептики и ставят компрессы на пораженный участок.

Другая терапевтическая тактика требуется тогда, когда в процесс вовлечена инфекция (герпес, скарлатина, ветрянка). В подобных ситуациях требуется общая терапия, подразумевающая применение средств для укрепления защитных сил организма, антивирусных препаратов, местных мазей.

Очень хорошо себя зарекомендовали противогрибковые и антибактериальные средства

при грибковых поражениях. Иногда не обойтись без пломбирования и вырывания зубов.

Если человек не соблюдал гигиену полости рта, доктор назначает профессиональную чистку и детально объясняет пациенту, какие мероприятия гигиены нужно выполнять. При легкой стадии воспалительного процесса этого будет достаточно.

Когда стоматит сопровождается отечностью или образованием язв, также у человека возникает болезненность при употреблении пищи, необходимо посетить стоматолога и пройти курс лечения, в противном случае болезнь перейдет в хроническую стадию и пострадают другие органы.

Почему слизистые повреждаются и облезают

Иногда пациент жалуется на болезненность неба. Часто это происходит при поражении слизистой части в процессе распития горячих напитков. Ткани слизистых очень нежные и уязвимые. Часто их целостность разрушается в результате приема твердых продуктов. Болезненные симптомы возникают обычно через два дня. Это происходит из-за поступления патогенной микрофлоры, чем и вызывается воспалительный процесс. Чтобы это исключить, необходимо применить раствор с витамином А и делать полоскания с настоями трав.

Часто стоматиты появляются при потреблении цитрусовых, семечек, особенно, если щелкать их зубами. Необходимо минимизировать потребление кислого. При появлении воспаления нужно воспользоваться антисептиком.

Одной из причин воспаления полости рта являются употребление цитрусовых

Слизистая оболочка облезает из-за имеющихся нарушений в неврологии. Широкую популярность получили

следующие причины:

  • регулярные эмоциональные и нервные переживания, постоянная интеллектуальная нагрузка;
  • химическое поражение из-за чрезмерного увлечения алкоголем;
  • поражение горячими блюдами;
  • болезни системы ЖКТ.

Если у человека возникли проблемы с системой пищеварения, слизистая часть начинает облезать абсолютно спонтанно. Необходимо обязательно посетить доктора, который займется диагностикой и назначит правильное лечение.

При ожогах химического характера терапия ограничивается использованием возобновляющих препаратов. Если всему виной иммунная система или нервы, тогда целесообразно использовать средства для укрепления защитных сил организма. Нужно помнить о процедуре полоскания, применении трав и специальных лекарственных средств.

Воспаление полости рта и пирсинг

Иногда стоматиты возникают у любителей проколов в языке. Это объясняется тем, что перед проколом следует провести правильную санацию ротовой полости и принимать специальные витаминные и минеральные комплексы.

Пирсинг — частая причина появления воспаления полости рта

Стоматологи крайне не советуют ничего прокалывать во рту, иначе в этом случае возрастает риск появления инфекции и разных болезней.

Аллергия и стоматит

Сегодня с ухудшением экологической ситуации, неправильным образом жизни, вредными привычками, современный человек все чаще страдает аллергией. К данному заболеванию могут привести медикаментозные средства, продукты питания, пыль, растения и т.д.

Часто воспаляется слизистая во рту на фоне течения контактного стоматита. Больных беспокоит сильное жжение, сухость, болезненность при глотании. Слизистые и язык отекают, отпечатываются зубы, возникают язвочки, пузырьки, другие образования.

Чтобы избавиться от данной проблемы, важно исключить раздражающий фактор. Для внутреннего применения используют антигистаминные средства, которые могут быть назначены в качестве компрессов.

Одним из основных принципов лечения является назначение антигистаминных средств. Важной частью лечения служит терапия витаминными комплексами. Для местного лечения применяют антисептики, анальгетики и другие препараты в форме гелей, мазей, паст.

Курение и стоматиты

У тех, кто злоупотребляет курением, очень часто воспаляются слизистые полости рта. Такие люди не могут предотвратить вероятность появления воспалительного процесса, так как влияние табака гораздо сильнее. Это вещество угнетает всю полезную флору.

Курение — одна из причин воспаления полости рта

Поэтому, не удивительно, что данная проблема распространена среди курильщиков. Если человек не откажется от данной привычки в пользу здоровья, то последствия могут быть очень печальными. При этом больной должен полоскать и обрабатывать слизистые мазями, антисептиками.

Когда человек выбирает здоровый образ жизни, то болезнь тут же может отойти, а если человек продолжает курить, несмотря на проблемы, патологический процесс только осложнится. Никотин способен поражать тонкие слоя и защитные функции.

Стоматит – болезнь диабетиков

На данной группе пациентов стоит также акцентировать внимание. Дело в том, что при диабете слизистые во рту фактически всегда воспалены, недостаточно увлажнены, потресканы.

Терапия стоматитов у людей, страдающих диабетом, достаточно сложна. Пациенты должны с особой серьезностью относиться к санации рта, регулярно орошать ротовую полость антисептиками.

Профилактика в целях предупреждения любых воспалений достаточно проста. Каждый человек должен регулярно ухаживать за собой, чистить зубы, пользоваться зубной нитью, тщательно полоскать рот после трапезы.

Необходимо внимательно относиться к особенностям питания. Исключить вредную и тяжелую для переваривания пищу. Откажитесь от курения и не злоупотребляйте спиртными напитками. Принимайте витаминные комплексы, укрепляйте иммунную систему.

Частые вопросы пациентов доктору

Как долго мои зубы будут болеть

Ожидайте, что зубы будут чувствительными первые несколько дней после того, как будут установлены ваши брекеты. Принимайте Ibuprofen для облегчения дискомфорта. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ TYLENOL. Зубы не будут беспокоить Вас, когда Вы не принимаете пищу, и в то время, когда Вы занимаетесь другими делами. Но это не значит, что совсем не надо кушать. Чем скорее Вы начинаете жевать, тем быстрее привыкните. Жевательную резинку без сахара МОЖНО ЖЕВАТЬ в течение 3 дней после начала лечения.

Для чего нужен фтор

Мы рекомендуем Вам на протяжении всего лечения пользоваться растворами для полоскания полости рта, содержащими фтор, в целях профилактики кариеса. Мы знаем, что Вы, вероятно, имеете фтор в вашей зубной пасте, но это другое. Это защитит ваш рот ночью во время сна. Это очень важно и поможет избежать белых пятен, которые могут появиться на ваших зубах, если их не чистить должным образом. Это помогает, если Вы следуете нашей диете и не употребляете легкие спиртные напитки (вино и т.п.), которые являются очень кислыми и содержат много сахара. Помните, это ваши зубы, пожалуйста, заботьтесь о них.

Внутренняя часть моих губ всегда ли будет воспалена

Ожидайте, время от времени, что ваши щеки и губы могут быть раздраженными. В конечном счете, ваша слизистая огрубеет и перестанет реагировать. Если появляются язвочки, используйте воск, который мы дали Вам и закрывайте им брекеты, которые причиняют неудобства. Воск останется на месте даже во время еды, если Вы удостоверитесь, что область сухая перед помещением воска. Возьмите маленький кусочек, скатайте его в небольшой шарик и поместите на брекет. Также, для скорейшей адаптации Вашей слизистой, мы рекомендуем полоскать полость рта отваром коры дуба, но только, если у вас не косметические брекеты.

Я все еще должен посещать своего стоматолога для осмотра и профессиональной гигиены

ДА, ДА, ДА. Пожалуйста, продолжайте посещать своего стоматолога для профессиональной гигиены. Мы бы хотели знать, что Вы ходите к нему на прием каждые четыре месяца, а не каждые шесть месяцев, как обычно. Это очень важно. Также мы бы хотели, если это возможно, совмещать ваше назначение к гигиенисту с посещением ортодонта так, чтобы мы могли удалять ваши дуги для чисток. Это облегчает работу гигиениста. Если Вы планируете профессионально почистить зубы, пожалуйста, сообщите нам заранее (по крайней мере, за 4 недели) так, чтобы мы могли скоординировать назначения. Спасибо

Почему между передними зубами появляется пространство

Иногда некоторые вещи могут выглядеть хуже перед тем, как они будут смотреться лучше. Зубы будут двигаться в разных направлениях, потому что они выравниваются. Вы можете заметить промежутки между вашими передними зубами, которых не было никогда там прежде или зубы, которые казались совершенно ровными перед лечением, после приклеивания брекетов, выглядят не так ровно. Пожалуйста, будьте терпеливее, и ситуация начнет улучшаться. Пространство между зубами закроется, и все зубы выровняются, я обещаю. При исправлении положения самого плохо расположенного зуба, может ухудшиться положение других зубов, но, в конечном счете, они все работают вместе, в единой системе, чтобы подарить Вам красивую улыбку…

Я ел только картофельное пюре, как вдруг один из брекетов отклеился…

Брекеты не всегда отклеиваются немедленно после того, как они ослаблены. Иногда жесткий леденец, баранка, или корочка пиццы ослабляет клей, но не достаточно для того, чтобы брекет оторвался сразу. Это может произойти в другой раз, когда Вы будете сидеть в классе или кушать картофельное пюре. Очень важно, чтобы Вы сообщили нам об этом как можно скорее (не обязательно в выходной день). Брекет не обязательно должен быть заменен сразу же, но мы хотим знать о том, что произошло даже, если Вы просто оставите сообщение у регистратора. Если Вы ждете до дня вашего приема, чтобы сообщить нам о поломке, то может случиться так, что мы не сможем произвести ремонт. Если же мы узнаем раньше, то сможем принять меры.

Мои зубы подвижны, хорошо ли это? Вдруг они выпадут…

Да, это нормально. Не волнуйтесь, зубы не выпадут, если, конечно, они не молочные. Необходимо, чтобы они оставались такими, пока мы будем перемещать их. Если они станут излишне подвижными, мы сообщим Вам, но это бывает редко. Большинство людей замечает это после удара локтем или мячом или после другой травмы. Между прочим, никакая нагрузка не должна быть причиной выпадения постоянного зуба (только молочного).

Сколько мне еще носить брекеты

Помните, время, которое мы Вам назвали – это грубая оценка. Может потребоваться намного больше времени или, наоборот, не так много. То, что происходит на протяжении лечения, очень часто зависит от Вас. Время лечения увеличится, если Вы не носите эластичную кольца, если Вы любите жевать резинку, если Вы непрерывно ломаете свой аппарат, если Вы уезжаете отдыхать на все лето. Даже, если все идет гладко, может потребоваться более длительное время. Никакие два человека не имеют одинаковые зубы, которые перемещаются по одному и тому же пути, и мы не хотим мчаться к заключительному результату, потому что Вашего друга вылечили быстрее. Выяснение в каждое посещение, “сколько мне еще носить брекеты? ”, не поможет Вам закончить лечение раньше. Но никто не может помешать Вам стремиться к этому! Не надо каждое посещение доказывать вашему ортодонту, что он мог бы закончить ваше лечение раньше. Это не приведет ни к чему хорошему. Помните, очень многое в лечении зависит от Вас и от вашего сотрудничества с ортодонтом. Удачи!

Воспаление слизистой оболочки – обзор

Мукозит

Мукозит относится к повреждению слизистой оболочки полости рта, которое приводит к повышению проницаемости сосудов, отеку тканей, атрофии и, в конечном итоге, изъязвлениям, покрытым некротической псевдомембраной в некоторых случаях. Кровотечение может быть связано с более поздними поражениями. Больные обычно жалуются на чувство жжения и могут не переносить горячую или острую пищу. Эти поражения, как правило, проходят сами по себе и обычно исчезают в течение 2–3 недель после завершения терапии. 48

Мукозит чаще всего связан с химиотерапией и применением лучевой терапии при лечении рака. Обычно это происходит в первые 2 недели терапии. Процент пациентов с тяжелым мукозитом сильно зависит от схемы химиотерапии, места облучения и дозы. От семидесяти пяти до 80% пациентов с трансплантацией костного мозга, прошедших курс кондиционирования с высокодозной химиотерапией и лучевой терапией, испытывают мукозит. 49

Профилактика и лечение мукозита не ограничиваются дискомфортом и болью в полости рта.При лечении рака это может привести к ухудшению питания, задержке введения лекарств, опасному для жизни септицемии и увеличению продолжительности пребывания в больнице и увеличению затрат. 50

Основанные на фактических данных рекомендации по профилактике и лечению мукозита, разработанные Многонациональной ассоциацией поддерживающей терапии при раке и Международным обществом онкологии полости рта, рекомендуют бензидамина гидрохлорид (HCl) для предотвращения мукозита. Этот нестероидный ополаскиватель с противовоспалительными, обезболивающими, антимикробными и анестезирующими свойствами проходит испытания в фазе III и пока недоступен в Соединенных Штатах.По-видимому, он уменьшает как тяжесть, так и продолжительность радиационно-индуцированного мукозита. 49 Несколько многообещающих новых препаратов, также проходящих испытания фазы III, включают Repifermin (человеческий фактор роста кератиноцитов 2) и AES-14 (L-глютамин). 49 Раннее исследование Репифермина показало значительное снижение частоты и продолжительности тяжелого орального мукозита у пациентов, перенесших трансплантацию. Испытания AES-14 продемонстрировали связанную с этим более низкую частоту тяжелого орального мукозита. Хотя паллиативное лечение включает вязкий лидокаин и каолин-пектин или дифенгидрамин, мукоадгезивы для покрытия слизистых оболочек и капсаицин, ни один из этих агентов не имеет достаточных доказательств, чтобы гарантировать рекомендации.Хотя хлоргексидин для полоскания рта можно использовать в качестве противозубного и противогрибкового средства при уходе за полостью рта, он не предотвращает и не лечит мукозит. 49

После избавления пациента от мукозита он или она должны продолжать потреблять достаточное количество жидкости для поддержания гидратации. Следует поддерживать диету с высоким содержанием белка и питательных веществ, чтобы обеспечить адекватное потребление питательных веществ. Пациентам следует избегать твердой, хрустящей пищи, кислой или кислой пищи, а также острой и соленой пищи, поскольку они раздражают слизистую оболочку полости рта.Местные анальгетики могут свести к минимуму боль от мукозита, связанного с приемом пищи. Антиоксиданты, такие как витамины Е, С и селен, были предметом клинических испытаний, в которых изучались модуляторы повреждения свободными радикалами, связанного с лучевой терапией и химиотерапией. Выводы остаются противоречивыми. 51

Удаление зубного налета снижает бактериальную нагрузку полости рта и частоту возникновения, тяжесть, кровотечение и боль, связанную с терапией рака, связанную с мукозитом. Это предотвращает инфекции мягких тканей, которые могут привести к системным осложнениям. 49 Протоколы ухода за полостью рта, включая чистку зубов, полоскание хлоргексидином и солевым раствором, снижают частоту и тяжесть мукозита на 38%. 52 Использование пенных зубных щеток не рекомендуется для борьбы с зубным налетом у пациентов с мукозитом, а использование ополаскивателей для полости рта, содержащих спирт, должно быть сведено к минимуму. 49 Пациентам с хроническим рецидивирующим мукозитом может потребоваться более частая профессиональная профилактическая помощь.

Границы | Слизистая оболочка полости рта, слюна и инфекция COVID-19 при уходе за полостью рта

Введение

Коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19) — это инфекционное заболевание, которое впервые было выявлено в больших количествах в Ухане, Китай; его вызывает недавно обнаруженный коронавирус, идентифицированный как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) (1).Коронавирусы представляют собой большие РНК-вирусы с бета-коронавирусами, включая SARS-CoV и SARS-CoV-2, которые оказались самыми смертоносными вирусами, вызывающими респираторный дистресс-синдром (2, 3). С 1960 года было обнаружено шесть коронавирусов, вызывающих заболевания у людей. В 2002 г. SARS-CoV вызвал крупную вспышку, известную как тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС), в результате которой во всем мире погибло около 10 000 человек (4). Лишь десятилетие спустя другой патогенный коронавирус, известный как коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), вызвал эндемию в странах Ближнего Востока (4, 5).SARS-CoV-2 является седьмым представителем семейства коронавирусов, поражающим людей (4). Интересно, что геном SARS-CoV-2 совмещен с геномами вирусов летучих мышей (Bat-CoV и Bat-CoV RaTG13) у видов Rhinolophus affinis из провинции Юньнань с сходством 96%; структурный анализ выявил мутацию в белке оболочки (белке Spike) и белке нуклеокапсида (6). Коронавирус имеет простую структуру с небольшим количеством белков (7). Существует 4 основных структурных белка: белок оболочки (Е), шиповидный белок (S), трансмембранный белок (М) и нуклеопротеин (N).Белки E, S и M облегчают проникновение вируса в клетки-хозяева, сборку вириона и патогенез вируса. Вирусный геном находится в тесной связи с белком N, а также помогает белку E в сборке вириона (7).

В настоящее время выявлено два пути передачи SARS-CoV-2: прямая и непрямая передача. Прямая передача включает контакт с биологическими жидкостями инфицированного человека, каплями из дыхательных путей или слюны, а также с другими биологическими жидкостями, такими как фекалии, моча, сперма и слезы (8).Признаки и симптомы COVID-19 можно разделить на респираторные и экстрареспираторные проявления. Наиболее распространенными респираторными симптомами являются кашель, лихорадка и одышка (9–11). Существует широкий спектр внереспираторных признаков и симптомов, включая поражения слизистой оболочки полости рта и неврологические дисфункции, такие как потеря обоняния, потеря вкуса, головная боль и связанная с ней миофасциальная боль; теперь они включены в диагностические критерии этого заболевания (таблица 1) (10, 19).

Таблица 1 .Орофациальные проявления COVID-19.

Полость носа, носоглотка, ротоглотка и ротовая полость идентифицированы как потенциальные места репликации вируса SARS-CoV-2 (20, 21). Полость рта, богатая слюной и ротовым микробиомом, является хорошо известным местом, где обитают различные типы респираторных вирусов (22, 23). Было обнаружено, что ротовая слюна содержит большое количество вирусов, что позволяет предположить, что слюнные железы являются местами активного размножения этого вируса (20, 24). Кроме того, ксеростомия и потеря вкуса могут быть связаны с дисфункцией слюнных желез, связанной с COVID-19 (23, 25).Однако эти признаки часто маскируются более опасными для жизни респираторными признаками и симптомами, которые в большинстве случаев требуют неотложной медицинской помощи. Этот обзор был направлен на предоставление гистологических характеристик слизистой оболочки полости рта и ее функционального значения при инфекции SARS-CoV-2, уделяя особое внимание орофациальным проявлениям и их влиянию на стоматологическую профессию.

Слизистая оболочка полости рта

Слизистая оболочка полости рта представляет собой специализированный слизистый наружный слой полости рта, состоящий из многослойного плоского эпителия и подлежащей соединительной ткани (собственная пластинка) (рис. 1) (26).Помимо обычных эпителиальных функций, таких как защита и выстилка, слизистая оболочка полости рта регионально специализирована для формирования особых функций, таких как восприятие вкуса, сенсорное восприятие, жевание и секреция (26). Эпителиальные клетки ротовой полости обладают многочисленными структурными и функциональными особенностями, позволяющими противостоять физическим и химическим воздействиям. Плоский эпителий обладает структурными свойствами, такими как расслоение и ороговение кератиноцитов, а также специфическими межклеточными взаимодействиями для поддержания их барьерных функций (26).Эпителиальные клетки метаболически активны и способны реагировать на внешние раздражители путем синтеза ряда цитокинов, молекул адгезии, факторов роста и хемокинов (27). Полость рта представляет собой динамическую экосистему, которая со временем меняется способами, влияющими на пространственные модели сборки микробного сообщества (28). Среди микробного сообщества полости рта распространены комменсалы, которые могут быть условно-патогенными микроорганизмами, когда иммунитет хозяина скомпрометирован. Существует множество видов бактерий, грибков и вирусов, которые являются либо патогенными, либо условно-патогенными и вызывают распространенные заболевания полости рта, такие как кариес и пародонтит, кандидоз полости рта и вирусные инфекции слизистой оболочки (29, 30).

Рисунок 1 . Модифицированное изображение, показывающее расположение точек входа SARS-CoV-2 и передний вид полости рта, помечающий различные области слизистой оболочки полости рта. (A) Синие стрелки указывают на носовое и оральное проникновение вируса. Расположение обонятельного эпителия и вкусовых луковиц (ВБ). Обонятельный эпителий располагается на крыше носовой полости. Вкусовые сосочки можно найти на языке, миндалинах и ротоглотке. (Б) Специфическое расположение многослойного плоского ороговевающего эпителия (ССКО) и многослойного плоского неороговевающего эпителия (ССНО) в полости рта.https://www.informedhealth.org/how-do-the-tonsils-work.html, « Как работают миндалины?» Институт качества и эффективности в здравоохранении (IQWiG, Германия), 17 января 2019 г.

Патогенез SARS-CoV-2 на слизистой оболочке полости рта

Вирусные инфекции полости рта являются распространенной клинической жалобой в стоматологии, которая часто связана с поражением слизистой оболочки полости рта. Группа вирусов герпеса (простой герпес 1–8), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирус Зика способны инфицировать и размножаться на слизистой оболочке полости рта, вызывая болезненные язвы во рту (22, 27).Было обнаружено, что такие вирусы, как парамиксовирус, ВИЧ, цитомегаловирус и вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), размножаются в слюнных железах и негативно влияют на нормальное функционирование слюнных желез (22). В нескольких недавних сообщениях описаны оральные проявления инфекции SARS-CoV-2, такие как везикулярно-буллезные поражения и изъязвления (24, 25, 31).

Исследования экспрессии ACE2 с помощью одноклеточной РНК-секвенции (scRNA-Seq) выявили высокие уровни экспрессии в ороговевших эпителиальных клеточных поверхностях полости рта, таких как спинка языка и твердое небо, а не в щечных или десневых тканях ( 32).Известно, что в организме человека рецептор ACE2 играет важную роль в регуляции гомеостаза артериального давления путем регулирования ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), где он превращает ангиотензин I в ангиотензин II; это каскадирует функции организма для поддержания артериального давления и удержания натрия в воде (33). SARS-CoV-2 проникает в тело хозяина и вторгается в клетки хозяина через мембранный рецептор ACE2; это связывание приводит к конформационным изменениям и отщеплению белка S от вириона и высвобождению нуклеокапсида в цитоплазму (7, 34).Белок S протеолитически расщепляется клеточным катепсином L и трансмембранной протеазой серином 2 (TMPRSS2) (33). Хага и др. обнаружили, что вирусы SARS-CoV могут индуцировать зависимое от фактора некроза тканей (TNF)-α-превращающего фермента (TACE) выделение эктодомена ACE2, и этот процесс был связан с продукцией TNF-α (35, 36). TNF-α представляет собой воспалительный цитокин, продуцируемый макрофагами/моноцитами во время острого воспаления, и отвечает за широкий спектр сигнальных событий внутри клеток, приводящих к некрозу или апоптозу клеток (37).Эти данные свидетельствуют о том, что клеточные сигналы, запускаемые взаимодействием SARS-CoV с ACE2, положительно участвуют в проникновении вируса, но приводят к повреждению тканей. Наличие высокой экспрессии ACE2 в альвеолярных тканях, клетках слизистой оболочки ротоглотки, желудочно-кишечном тракте, почках и эндотелиальных клетках, включая ткани полости рта, указывает на то, что эти органы с высоким уровнем экспрессии ACE2 следует рассматривать как участки потенциально высокого риска для SARS-CoV. -2 (21, 32).

Оральные проявления COVID-19

Патология вирусных инфекций часто связана либо с клеточной деструкцией из-за вирусной инвазии, либо с следствием иммунной реакции хозяина на вирусный антиген (23).В слизистой оболочке полости рта вирусные инфекции разрушают эпителиальные клетки и вызывают местные воспалительные реакции, которые обычно проявляются резким началом и сочетанием одиночных или множественных волдырей или изъязвлений (23). Везикулы в полости рта, волдыри, макулярная популярная сыпь и изъязвления являются общими клиническими признаками вирусных инфекций (23). При SARS-CoV-2 повреждение эпителия вызывает сходные патогенные признаки в тканях полости рта, такие как язвы, эрозии, буллы, везикулы, пустулы, складчатый или депапиллярный язык, макула, папула, налет, пигментация, неприятный запах изо рта, беловатые участки, геморрагические корки. , некроз, петехии, отек, эритема, Кавасаки-подобный ангулярный хейлит, атипичный синдром Свита и синдром Мелькерсона-Розенталя (19, 25, 38).Наиболее частыми местами поражения являются язык (38%), слизистая оболочка губ (26%) и небо (22%) (19, 39). Поражения полости рта были почти одинаковыми у обоих полов (49% женщин и 51% мужчин). У пациентов старшего возраста и более тяжелой формы заболевания COVID-19 были более распространенные и тяжелые поражения полости рта (25).

Гистологический анализ поражений полости рта SARS-CoV-2 связан с дефектами сосудистого расположения слизистой оболочки полости рта (40). Патогенез поражения слизистой оболочки полости рта при COVID-19 связан с накоплением лимфоцитов и клеток Лангерганса в сосудистой сети подкожных соединений, а вирус вызывает разрушение кератиноцитов цитотоксическими лимфоцитами (41).Гистологическое исследование биоптатов пациентов с COVID-19, у которых также были кожные проявления, подтвердило сосудистую эктазию с расширенными капиллярами, большими заполненными кровью пространствами и периваскулярным лимфоцитарным инфильтратом с эозинофилией (40).

Было обнаружено, что отсутствие гигиены полости рта, оппортунистические инфекции, стресс, иммуносупрессия, васкулит и гипервоспалительная реакция, вторичная по отношению к COVID-19, являются предрасполагающими факторами для возникновения поражений полости рта у пациентов с COVID-19 (19, 39). Стресс-индуцированные язвы во рту могут увеличиться среди пациентов из-за неизвестного страха перед пандемией.Уже сообщалось, что эта пандемия серьезно повлияла на психическое здоровье мирового сообщества (42). Пациенты сообщали об изменениях чувствительности языка, бляшечных изменениях языка и опухании неба, языка и десен (25). Поражения языка могут быть связаны с усилением вирусной активности эпителиальной слизистой оболочки языка (39). С другой стороны, подавление иммунитета может привести к укрытию условно-патогенных микроорганизмов, таких как Candida albicans , что может привести к описанным выше поражениям языка (19).Поражения полости рта, вызванные SARS-CoV-2, зажили в период от 3 до 28 дней после их появления. Вызванные COVID-19 поражения слизистой оболочки полости рта можно лечить с помощью ополаскивателей для рта, местных или системных кортикостероидов, системных антибиотиков и противовирусных препаратов (39, 40). Появляется все больше доказательств того, что антисептические жидкости для полоскания рта, такие как хлоргексидин, гипохлорит натрия и повидон-йод, оказались эффективными в снижении вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в полости рта и могут назначаться пациентам с поражениями слизистой оболочки в качестве первой линии терапии. (43, 44).Местные или системные кортикостероиды, системные антибактериальные и противовирусные препараты необходимо назначать в соответствии с индивидуальными потребностями пациента. Междисциплинарный командный подход важен при назначении или продолжении системных кортикостероидов, антибиотиков или противовирусных препаратов для лечения поражений слизистой оболочки полости рта, вызванных COVID-19 (39).

Потеря вкуса и обоняния, вызванная COVID-19

Вкус — это особое ощущение слизистой оболочки полости рта человека, которое играет жизненно важную роль в определении питательных веществ и регуляции приема пищи.Люди способны различать пять основных вкусов: сладкий, кислый, соленый, горький и умами. Вкусы стимулируют специализированные клетки, известные как клетки вкусовых рецепторов (TRC), которые содержат белки передачи вкусовых сигналов. Кислый и соленый вкусы модулируют функцию TRC путем прямой активации специализированных мембранных каналов (45, 46). Напротив, трансдукция сладкого, горького вкуса и вкуса умами опосредуется через сигнальный путь рецептора, связанного с G-белком (GPCR) (47). TRC локально организованы в виде вкусовых рецепторов (TB), которые расположены на спинке языка, а внеротовые вкусовые рецепторы можно найти в миндалинах и ротоглотке (рис. 1А).ТБ состоят из рецепторных клеток, поддерживающих клеток и иннервируются ветвями VII (лицевого), IX (языкоглоточного) и X (блуждающего) черепных нервов. Информация о вкусе передается в мозг, и ее распознавание вызывает поведенческие реакции на пищу (48, 49). Истинная потеря вкуса встречается крайне редко, и обычно ей предшествует неспособность воспринимать запах пищи из-за обонятельной дисфункции или дефицита слюны для растворения молекул пищи для попадания на вкусовые рецепторы (25, 50).

Запахи или одоранты достигают обонятельного эпителия, который покрывает решетчатую пластинку и верхнюю часть носовой перегородки и средние/верхние носовые раковины, и растворяются в слое слизи, связывая/активируя обонятельные рецепторы (рис. 1А). В обонятельном эпителии можно найти до 30 миллионов рецепторных нейронов, которые экспрессируют до 350 различных обонятельных рецепторов. Сложная комбинаторная кодировка, с помощью которой каждый ароматический лиганд может быть распознан комбинацией обонятельных рецепторов, позволяет людям обнаруживать миллиарды различных запахов.Обонятельная информация, которая обрабатывается и интегрируется в обонятельной луковице, затем проецируется на первичные обонятельные центры, такие как лимбическая система (эмоции) и гипоталамус (память), и, наконец, проецируется в обонятельную кору, где люди приобретают сознание. обоняния (50, 51). Потеря обоняния при респираторных инфекциях является многофакторной и вызвана сочетанием механической обструкции передачи запаха в обонятельной щели из-за воспаления слизистой оболочки 2-го типа (отек или назальные полипы), что приводит к отслоению и/или дегенерации обонятельного эпителия и снижение или потеря обоняния (51).

Внезапная потеря вкуса и обоняния, связанная с инфекцией SARS-CoV-2, была зарегистрирована в нескольких странах в начале марта на фоне быстрого увеличения числа пациентов с COVID-19. Интересно, что в разных странах сообщалось о серии спорадических случаев, преимущественно у медицинских работников, о внезапной, тяжелой, а иногда и изолированной потере обоняния и/или вкуса (50, 52). Было обнаружено, что заложенность носа является движущим фактором потери обоняния. Возможно, что повреждение обонятельного нейроэпителия может вызвать дефекты обнаружения запахов.Потеря обоняния распространена среди женщин, а потеря обоняния в большинстве случаев связана с потерей вкуса (51, 53).

Тем не менее, отсутствуют данные о конкретных потерях различных вкусовых добавок (ароматов) (54). В онлайн-опроснике ( n = 128) 67 пациентов (52%) сообщили об изменениях вкусовых ощущений. 52 пациента сообщили об изменении восприятия острого вкуса, 54 — соленого, 53 — кислого и 61 — сладкого. При сравнении мужчин и женщин COVID-19 вызывает изменения вкуса, и изменения во вкусовых подгруппах оказались обычным явлением среди женщин, но это требует дальнейших исследований (55, 56).Возможная причина потери вкуса при COVID-19 может быть связана с увеличением количества рецепторов ACE-2 на кератиноцитах языка, а гибель клеток кератиноцитов и образование шелушения могут блокировать вкусовые рецепторы, что может отрицательно повлиять на восприятие вкуса (53, 57). ). Однако активность рецептора ACE-2 в клетках вкусовых рецепторов в настоящее время неизвестна, поэтому необходимо дополнительно изучить конкретную роль SARS-CoV-2 в определенных клетках вкусовых почек (рецепторных клетках и поддерживающих клетках) (57).Было показано, что GPCR можно обнаружить в различных тканях организма, не только в ротовой полости, но и в эпителиальных клетках легких, гематоэнцефалическом барьере и кровеносных сосудах (58). Будет интересно увидеть конкретную роль взаимодействия SARS-CoV-2 и GPCR с точки зрения патогенеза COVID-19. С другой стороны, COVID-19 вызывает дисфункцию слюнных желез, что приводит к сухости во рту и может привести к нарушению вкусового восприятия (59). Лечение искусственной слюной может уменьшить потерю вкуса, вызванную ксеростомией (60).Количественное тестирование запаха показывает, что снижение функции обоняния является основным маркером инфекции SARS-CoV-2, и предполагает, что тестирование запаха может в некоторых случаях помочь выявить пациентов с COVID-19, нуждающихся в раннем лечении или карантине (61). . Сонг и др. обнаружили, что потеря вкуса у госпитализированных пациентов была более частой (21%), чем потеря обоняния (11%), причем потеря вкуса, но не обоняния, была связана с тяжелой формой COVID-19 (62). У большинства пациентов нарушение обоняния и вкуса восстановилось в течение 2 недель (50, 62).

В целом, нет никаких реальных данных о каком-либо конкретном фармакологическом варианте лечения поствирусной потери обоняния, включая COVID-19. В некоторых исследованиях сообщается об улучшении обонятельной функции после местной или системной терапии кортикостероидами (50, 63). Обонятельная тренировка является единственным в настоящее время научно обоснованным терапевтическим вариантом поствирусной потери обоняния, при этом пациенты с положительным результатом на COVID-19 сообщают об улучшении обоняния (45,6%) и вкуса (46,1%) на момент опроса; в 90,6% это произошло в течение 2 недель после заражения (64).Более 90% пациентов с COVID-19 с потерей обоняния могут восстановить это обоняние в течение первого месяца, и настоятельно рекомендуется обучение обонянию, если обоняние не восстановилось после этого периода времени, но его можно начать раньше (65).

Роль слюны в патогенезе COVID-19 и диагностике заболеваний

Слюна человека представляет собой уникальную жидкость организма ротовой полости. Это гипотонический раствор слюнных ацинусов, жидкости десневой борозды и экссудата слизистой оболочки полости рта (66). Примерно 90% слюны выделяется слюнными железами; основные железы включают околоушные железы, поднижнечелюстные железы и подъязычные железы (66).Слюнные железы являются сильно сосудистыми образованиями, где происходит постоянный обмен веществ. Нормальный человек производит 600 мл слюны в день. Он в основном состоит из воды (94–99%), при этом на органические молекулы приходится ~ 0,5%, а на неорганические молекулы — 0,2% (66). Он выполняет функции смазывания слизистой оболочки полости рта, переваривания пищи, очистки и защиты полости рта и является одним из наиболее важных факторов, влияющих на гомеостаз полости рта.

Вирусные инфекции часто связаны с вызванным инфекцией воспалением слюнной железы (22).Биомаркеры на основе слюны полезны для диагностики нескольких вирусных инфекций, таких как вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, ВИЧ-1, вирус кори, вирус краснухи и вирус эпидемического паротита (66). Было предложено несколько путей проникновения вируса SARS-CoV-2 в слюну. Осуществляется прямое попадание в полость рта из выделений верхних и нижних дыхательных путей, а циркулирующие вирусы в крови попадают в жидкость десневой борозды. В исследованиях сообщается о большом количестве вирусных частиц в десневой борозде и жидкости борозды, что, как предполагается, создает благоприятные условия для репликации и поддержания вируса (32).Более того, инфекции слюнных желез SARS-CoV-2 могут продуцировать большое количество вирусов в тканях слюнных желез и выделять их в секрет (67). Исследования, проведенные на макаках-резусах, показали, что в эпителиальных клетках слюнных желез происходит быстрое заражение SARS-CoV, что позволяет предположить, что слюнные железы являются местами очень раннего размножения коронавирусов (68). Следовательно, повышенная экспрессия ACE-2 в малых слюнных железах по сравнению с легкими свидетельствует о том, что слюнные железы являются ранним органом-мишенью, и слюна может быть жизненно важным источником для ранней диагностики заболевания до появления респираторных симптомов (20, 31, 68).

При COVID-19 нарушение секреции слюнных желез часто сопровождается ксеростомией и потерей вкуса (69). Ксеростомия является субъективной жалобой на сухость во рту, в то время как гипофункция слюнных желез объективно характеризуется снижением слюноотделения (70, 71). При инфекциях SARS-CoV ксеростомия может усугубляться нарушением носового дыхания из-за заложенности носа и ринореи, когда учащается ротовое дыхание и может нарушаться функция слюнных желез, а ксеростомия является вторичной (25).Подобно поражениям слизистой оболочки полости рта, вызванным COVID-19, психосоциальные факторы, вызванные пандемией, оказывают большее влияние на нормальную функцию слюнных желез и количественную секрецию (25, 59).

Диагностике COVID-19 на основе слюны уделяется повышенное внимание по нескольким важным причинам. Во-первых, образцы слюны можно легко получить, попросив пациентов сплюнуть в контейнер, что не является инвазивной процедурой и сводит к минимуму вероятность заражения медицинских работников высокоинфекционным вирусом SARS-CoV-2; он также идеально подходит для тестирования пожилых уязвимых групп населения, педиатрических пациентов и общин, где требуется сбор больших образцов (таблица 2) (87).Положительный результат на SARS-CoV-2 в слюне составляет 92% по сравнению с аспиратом из носоглотки, и живой вирус можно успешно культивировать в образцах слюны, что подчеркивает ценность слюны для диагностики COVID-19 (88). Как обсуждалось ранее, раннее обнаружение SARS-CoV-2 в слюне может иметь жизненно важное значение для диагностики пациентов с COVID-19 до появления респираторных симптомов, что в значительной степени помогает контролировать меры общественного здравоохранения, такие как процесс карантина (20, 88, 89). .

Таблица 2 .Статьи, связанные с COVID-19 и стоматологией.

Будущие перспективы в отношении профессии стоматолога

11 марта 2020 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила COVID-19 глобальной пандемией. По состоянию на 20 января 2021 года во всем мире было зарегистрировано 96 866 468 случаев заболевания, 20 72 466 человек умерли. Первые случаи COVID-19 были зарегистрированы в Канаде 10 февраля 2020 г., и с тех пор было зарегистрировано 723 908 случаев заболевания и 18 421 летальный исход (90). Текущие правила общественного здравоохранения, направленные на предотвращение распространения этого вируса, основаны на способах передачи.Соблюдение строгих глобальных (ВОЗ) и канадских руководящих принципов общественного здравоохранения оказалось эффективным в предотвращении распространения COVID-19 (91, 92). Уже опубликовано несколько отличных исследований и обзорных статей о влиянии COVID-19 на клиническую стоматологию и важности полости рта при инфекции SARS-CoV-2 (таблица 2) (24, 72, 93). Стоматологические регулирующие органы быстро адаптировали новые правила и положения в отношении ухода за пациентами и предотвращения распространения SARS-CoV-2 (72, 93).Среди медико-санитарных профессий стоматологи имеют высокий риск контакта с больными людьми и распространения болезни в внутрибольничных условиях.

Американская стоматологическая ассоциация разработала рекомендации по уходу за пациентами во время пандемии COVID-19 (94). Лечение зубов делится на неотложную/неотложную помощь и плановые/выборные процедуры. Стоматологические неотложные состояния, требующие немедленной медицинской помощи, включают опасные для жизни состояния, неконтролируемое кровотечение, отек и переломы, которые нарушают проходимость дыхательных путей пациента.Неотложная стоматологическая помощь должна быть направлена ​​на минимизацию боли, уменьшение или контроль инфекции и снижение нагрузки на отделения неотложной помощи (94). Помимо этого удаление швов, подгонка зубных протезов, замена пломб для облегчения боли, обрезка или подгонка ортодонтических приспособлений для предотвращения травм также считаются неотложной стоматологической помощью. К несрочным рутинным процедурам относятся первичные визиты к стоматологу, плановая чистка зубов и профилактические процедуры, эстетические стоматологические процедуры, удаление бессимптомных зубов и ортодонтические процедуры (94).Конечная цель — избегать ненужных контактов и минимизировать контакты, чтобы предотвратить дальнейшее распространение вируса в стоматологических учреждениях. Пандемия COVID-19 открывает множество инновационных технологий для встреч, таких как телеконференции, видеозвонки и фотографии пациентов. Brian и Weintraub обсуждают использование средств связи, таких как телестоматология, для обучения и консультирования пациентов в период пандемии, когда это значительно облегчит предотвращение ненужных посещений стоматолога в связи с состоянием, которое можно временно облегчить дома или отложить на более поздний срок (93). .Пациенты с сопутствующими заболеваниями, такими как диабет, рак, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) и гипертония, более восприимчивы к развитию COVID-19, поэтому требуют особого внимания. Например, диабет является нарушением обмена веществ, которое отрицательно влияет на здоровье пародонта. Заболевание пародонта (БП) — это хроническое воспалительное заболевание, которое вызывает повышенную выработку цитокинов, а тяжесть заболевания увеличивается при инфицировании COVID-19 (95). Важно выявить пациентов с сопутствующими заболеваниями и дать им рекомендации по поддержанию хорошей гигиены полости рта, чтобы предотвратить дальнейшее прогрессирование существующей болезни Паркинсона (таблица 2).

Стоматологический персонал должен пройти обучение, чтобы знать признаки и симптомы, связанные с COVID-19. Скрининг сортировки — это успешный метод выявления и разделения пациентов на три категории: (1) сортировка с отрицательным результатом (бессимптомные и отрицательные результаты в скрининговом опроснике и отсутствие лихорадки) (2) сортировка с положительным результатом (положительный результат скринингового опросника и/или лихорадка) (3) подтвержденных случаев COVID-19. Однако крайне важно соблюдать все необходимые меры предосторожности при лечении первой категории (82).Возможность проводить тщательный скрининг пациентов поможет избежать передачи COVID-19 в стоматологических клиниках. Неинвазивный экспресс-тест на скрининг мог бы оказать большую помощь в выявлении положительных случаев, требующих немедленного карантина или перевода в специальную клинику для дальнейшего лечения (88, 93). Текущие исследования сосредоточены на разработке биомаркеров для раннего выявления, лечения и профилактики COVID-19. В условиях ухода за полостью рта слюна и эпителиальные клетки слизистой оболочки являются хорошими кандидатами для разработки биомаркеров для выявления бессимптомных носителей (таблица 2).

Учитывая более высокую вирусную нагрузку в полости рта, необходимо использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ). Защитные очки или лицевые щитки, маски, перчатки и шапочки следует регулярно надевать, выбрасывать или надлежащим образом дезинфицировать после каждого пациента. Необходимо защищать от аэрозолей слюны и крови, чтобы снизить риск заражения COVID-19 (96). Использование коффердамов может значительно минимизировать образование брызг, капель и аэрозолей, загрязненных слюной, особенно при использовании высокоскоростных стоматологических наконечников и ультразвуковых устройств.Применение коффердама может значительно уменьшить количество взвешенных в воздухе частиц в операционном поле диаметром ~ 3 фута на 70% (97). Высокоскоростные стоматологические наконечники без клапанов, препятствующих ретракции, могут аспирировать и выталкивать мусор и жидкости во время стоматологических процедур; кроме того, ручные инструменты, используемые во время общих стоматологических процедур, выделяют значительное количество аэрозолей (72). Хорошая вентиляция, регулярная и тщательная дезинфекция поверхностей до и после процедур со спиртом или хлором, а также надлежащее обращение со слюносодержащими отходами имеют решающее значение для предотвращения распространения COVID-19 (96).Недавние исследования показывают, что ополаскиватели для рта могут снизить вирусную нагрузку SARS-CoV-2 (98). Маруи и др. показали, что полоскание рта перед процедурой может значительно снизить микробную нагрузку в стоматологических аэрозолях (99). Кроме того, использование ополаскивателей для полости рта перед стоматологическим лечением может быть полезным во время пандемии (100).

Мы слишком рано предсказываем постпандемические последствия COVID-19. Однако COVID-19 оказывает широкий спектр воздействий на психическое здоровье, что может негативно сказаться на здоровье полости рта в любом конкретном сообществе; в частности, большее влияние можно наблюдать на уязвимых группах населения, таких как люди с низким социально-экономическим статусом, не имеющие доступа к надлежащему медицинскому обслуживанию.С другой стороны, это непростое время для стоматологов, и это может повлиять на их психологическое состояние, что может отрицательно сказаться на их общей производительности. Например, внедрение новых методов для сведения к минимуму распространения болезней и снижение заработной платы, поскольку это связано со снижением количества посещений стоматолога на душу населения (93). Своевременная вакцинация медицинских работников и уязвимых групп населения в настоящее время является стратегическим приоритетом профилактики COVID-19 во многих странах.Дай и Гао в своей прогрессивной статье обсудили различные вакцины-кандидаты против SARS-CoV-2 (т. е. инактивированные вирусные вакцины, вирусоподобные вирусы с частицами или наночастицами, белковые субъединичные вакцины, вирусные векторные вакцины, ДНК- и мРНК-вакцины и живые аттенуированные вакцины). ) и сравнить их эффективность против COVID-19 (101). Крупнейшая в мире кампания по вакцинации начинается с вакцин BioNTech/Pfizer и Moderna/NIAID, и теперь вакцина Oxford-AstraZenca разрешена и добавлена ​​к этой массовой профилактической битве против COVID-19.Однако программы иммунизации нуждаются в дальнейшем изучении их эффективности против новых вариантов SARS-CoV-2 (101, 102). Необходимо провести дальнейшие исследования для выявления патогенности SARS-CoV-2 на конкретных эпителиальных органах полости рта и его влияния на здоровье полости рта. Исследование слюны может быть направлено на разработку наборов для экспресс-идентификации в качестве теста на стуле перед любыми стоматологическими процедурами для диагностики носителей SARS-CoV-2. Использование кортикостероидов, противовирусных препаратов и антибиотиков для лечения поражений слизистой оболочки полости рта при COVID-19 требует дальнейшего изучения с использованием больших выборок в различных демографических условиях.Продолжающаяся пандемия COVID-19 открывает всему человечеству глаза на бдительность и готовность к борьбе с будущими пандемиями. В частности, научные знания, полученные в результате этой пандемии, могут быть полезны при разработке протоколов общественного здравоохранения для предотвращения будущих пандемий и вакцин, а исследования в области терапевтического лечения будут иметь неоценимое значение для ведения пациентов с любыми вирулентными коронавирусными инфекциями.

Вклад авторов

DSA и RKR внесли свой вклад в концепцию и критически переработали рукопись.Оба автора внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Университет Манитобы за поддержку исследований в лаборатории Атукорале.

Каталожные номера

1. Бчетня М., Жирар С., Дюшен С., Лаприз С.Вспышка нового тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2): обзор текущего состояния в мире. J Заразить общественное здравоохранение. (2020) 13:1601–10. doi: 10.1016/j.jiph.2020.07.011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

2. Кришнамурти С., Суэйн Б., Верма Р.С., Гюнте С.С. Вирусы SARS-CoV, MERS-CoV и 2019-nCoV: обзор происхождения, эволюции, генетических вариаций. Вирусное заболевание. (2020) 31:1–13. дои: 10.1007/с13337-020-00632-9

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

3. Desforges M, Le Coupanec A, Stodola JK, Meessen-Pinard M, Talbot PJ. Коронавирусы человека: вирусные и клеточные факторы, участвующие в нейроинвазивности и нейропатогенезе. Вирус Рез. (2014) 194:145–58. doi: 10.1016/j.virusres.2014.09.011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

4. Шерин М.А., Хан С., Казми А., Башир Н., Сиддик Р. Инфекция COVID-19: происхождение, передача и характеристики коронавирусов человека. J Доп. рез. (2020) 24:91–8. doi: 10.1016/j.jare.2020.03.005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

5. Хасоксюз М., Килич С., Сарач Ф. Коронавирусы и SARS-COV-2. Терк J Med Sci. (2020) 50: 549–56. doi: 10.3906/sag-2004-127

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

6. Zhou H, Chen X, Hu T, Li J, Song H, Liu Y, et al. Новый коронавирус летучих мышей, тесно связанный с SARS-CoV-2, содержит естественные вставки в месте расщепления S1/S2 шиповидного белка. Современная биология: CB. (2020) 30:2196–2203.e3. doi: 10.1016/j.cub.2020.05.023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

7. Нойман Б.В., Бухмайер М.Дж. Супрамолекулярная архитектура частицы коронавируса. Adv Virus Res. (2016) 96:1–27. doi: 10.1016/bs.aivir.2016.08.005

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

8. Кариа Р., Гупта И., Хандайт Х., Ядав А., Ядав А. COVID-19 и пути его передачи. SN Compr Clin Med. (2020) 1–4. doi: 10.1007/s42399-020-00498-4. [Epub перед печатью].

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

9. Ричардсон С., Хирш Дж.С., Нарасимхан М., Кроуфорд Дж.М., Макгинн Т., Дэвидсон К.В. и соавт. Представляем характеристики, сопутствующие заболевания и исходы среди 5700 пациентов, госпитализированных с COVID-19 в районе Нью-Йорка. ЯМА. (2020) 323:2052–9. дои: 10.1001/jama.2020.6775

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

10.Аренц М., Йим Э., Клафф Л., Локхандвала С., Риедо Ф.Х., Чонг М. и др. Характеристики и исходы 21 тяжелобольного пациента с COVID-19 в штате Вашингтон. Джама. (2020) 323:1612–4. дои: 10.1001/jama.2020.4326

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

11. Гарг С., Ким Л., Уитакер М., О’Халлоран А., Каммингс С., Холштейн Р. и соавт. Показатели госпитализации и характеристики пациентов, госпитализированных с лабораторно подтвержденным коронавирусным заболеванием 2019 г. — COVID-NET, 14 штатов, 1–30 марта 2020 г. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. (2020) 69: 458–64. doi: 10.15585/mmwr.mm6915e3

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

12. Shi H, Han X, Jiang N, Cao Y, Alwalid O, Gu J и другие. Рентгенологические данные 81 пациента с пневмонией COVID-19 в Ухане, Китай: описательное исследование. Ланцет Infect Dis . (2020) 20:425–34. doi: 10.1016/S1473-3099(20)30086-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

13.Xu XW, Wu XX, Jiang XG, Xu KJ, Ying LJ, Ma CL и др. Клинические данные в группе пациентов, инфицированных новым коронавирусом 2019 года (SARS-Cov-2) за пределами Уханя, Китай: ретроспективная серия случаев. БМЖ . (2020) 368: m606. дои: 10.1136/bmj.m606

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

14. Френи Ф., Медури А., Газия Ф., Никастро В., Галлетти С., Арагон П. и соавт. Симптоматика в области головы и шеи при коронавирусной болезни (COVID-19): возможное нейроинвазивное действие SARS-CoV-2. Am J Отоларингол. (2020) 41:102612. doi: 10.1016/j.amjoto.2020.102612

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

15. Lechien JR, Chiesa-Estomba CM, De Siati DR, Horoi M, Le Bon SD, Rodriguez A, et al. Нарушения обоняния и вкуса как клиническая картина легких и среднетяжелых форм коронавирусной болезни (COVID-19): многоцентровое европейское исследование. Eur Arch Оториноларингол . (2020) 277:2251–61. doi: 10.1007/s00405-020-06024-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

16.Лай CC, Ko WC, Lee PI, Jean S-S, Hsueh P-R. Внедыхательные проявления COVID-19. Противомикробные агенты Int J . (2020) 56:106024. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.106024

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

19. Иранманеш Б., Халили М., Амири Р., Зартаб Х., Афлатунян М. Оральные проявления болезни COVID-19: обзорная статья. Дерматол Тер . (2020) 34:e14578. doi: 10.1111/dth.14578. [Epub перед печатью].

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

20.Wang WK, Chen SY, Liu IJ, Chen YC, Chen HL, Yang CF, et al. Обнаружение коронавируса, связанного с атипичной пневмонией, в смывах из горла и слюне при ранней диагностике. Emerg Infect Dis. (2004) 10:1213–9. дои: 10.3201/eid1007.031113

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

23. Сантош А.Б.Р., Муддана К. Вирусные инфекции полости рта. J Family Med Prim Care. (2020) 9:36–42. дои: 10.4103/jfmpc.jfmpc_807_19

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

25.Brandão TB, Gueiros LA, Melo TS, Prado-Ribeiro ACA, Nesrallah CFA, Prado GVB и др. Поражения полости рта у пациентов с инфекцией SARS-CoV-2: может ли полость рта быть органом-мишенью? Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. (2020) 131:e45–51. doi: 10.1016/j.oooo.2020.07.014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

30. Аас Дж.А., Пастер Б.Дж., Стоукс Л.Н., Олсен И., Дьюхерст Ф.Е. Определение нормальной бактериальной флоры полости рта. J Clin Microbiol. (2005) 43:5721–32. doi: 10.1128/JCM.43.11.5721-5732.2005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

32. Xu H, Zhong L, Deng J, Peng J, Dan H, Zeng X, et al. Высокая экспрессия рецептора ACE2 2019-nCoV на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта. Int J Oral Sci. (2020) 12:8. doi: 10.1038/s41368-020-0074-x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки

33. Датта П.К., Лю Ф., Фишер Т., Раппапорт Дж., Цинь Х. Пандемия SARS-CoV-2 и пробелы в исследованиях: понимание взаимодействия SARS-CoV-2 с рецептором ACE2 и последствия для терапии. Тераностика. (2020) 10:7448–64. doi: 10.7150/thno.48076

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

35. Хага С., Ямамото Н., Накаи-Мураками С., Осава Ю., Токунага К., Сата Т. и др. Модуляция фермента, превращающего ФНО-альфа, шиповидным белком SARS-CoV и ACE2 индуцирует выработку ФНО-альфа и облегчает проникновение вируса. Proc Natl Acad Sci USA. (2008) 105:7809–14. doi: 10.1073/pnas.0711241105

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

37.Идрисс Х.Т., Нейсмит Дж.Х. ФНО-альфа и надсемейство рецепторов ФНО: взаимосвязь структура-функция. Microsc Res Tech. (2000) 50:184–95. doi: 10.1002/1097-0029(20000801)50:3<184::AID-JEMT2>3.0.CO;2-H

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

38. Каррерас-Пресас КМ, Санчес Дж.А., Лопес-Санчес А.Ф., Джейн-Салас Э., Перес МЛС. Везикулобуллезные поражения полости рта, связанные с инфекцией SARS-CoV-2. Оральный дис. (2020) 3:13382. дои: 10.1111/оди.13382

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

39. Amorim Dos Santos J, Normando AGC, Carvalho da Silva RL, De Paula RM, Cembranel AC, Santos-Silva AR, et al. Поражения слизистой оболочки полости рта у пациента с COVID-19: новые признаки или вторичные проявления? Int J Infect Dis. (2020) 97: 326–8. doi: 10.1016/j.ijid.2020.06.012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

40. Круз Тапиа Р.О., Пераса Лабрадор А.Дж., Гимарайнш Д.М., Матос Вальдес Л.Х.Поражения слизистой оболочки полости рта у пациентов с инфекцией SARS-CoV-2. Отчет о четырех случаях. Являются ли они истинным признаком болезни COVID-19? Стоматология Spec Care. (2020) 40: 555–60. doi: 10.1111/scd.12520

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

41. Джанотти Р., Зерби П., Додюк-Гад Р.П. Клиническое и гистопатологическое исследование кожных дерматозов у ​​пациентов, пораженных инфекцией COVID-19, в северной части Италии. J Dermatol Sci. (2020) 98:141–3.doi: 10.1016/j.jdermsci.2020.04.007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

43. Carrouel F, Goncalves LS, Conte MP, Campus G, Fisher J, Fraticelli L, et al. Противовирусная активность реагентов в ополаскивателях для рта против SARS-CoV-2. J Стоматологический рез. (2021) 100:124–32. дои: 10.1177/0022034520967933

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

44. Yoon JG, Yoon J, Song JY, Yoon SY, Lim CS, Seong H и др. Клиническое значение высокой вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в слюне. Журнал корейской медицины. (2020) 35:e195. doi: 10.3346/jkms.2020.35.e195

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

45. Horio N, Yoshida R, Yasumatsu K, Yanagawa Y, Ishimaru Y, Matsunami H, et al. Реакция на кислый вкус у мышей с отсутствием каналов PKD. ПЛОС ОДИН. (2011) 6:e20007. doi: 10.1371/journal.pone.0020007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

46. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D, et al.Кодирование сладкого, горького вкуса и вкуса умами: разные рецепторные клетки имеют сходные сигнальные пути. Сотовый. (2003) 112: 293–301. doi: 10.1016/S0092-8674(03)00071-0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

47. Perez CA, Huang L, Rong M, Kozak JA, Preuss AK, Zhang H, et al. Канал транзиторного рецепторного потенциала экспрессируется в клетках вкусовых рецепторов. Nat Neurosci. (2002) 5:1169–76. дои: 10.1038/nn952

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

49.де Араужо, т.е. Саймон С.А. Вкусовая кора и мультисенсорная интеграция. Int J Obes (Лондон). (2009) 33 (Приложение 2): S34–43. doi: 10.1038/ijo.2009.70

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

50. Муллол Дж., Алобид И., Мариньо-Санчес Ф., Искьердо-Домингес А., Марин С., Климек Л. и соавт. Потеря обоняния и вкуса во время вспышки COVID-19: история многих стран. Curr Allergy Asthma Rep. (2020) 20:61. doi: 10.1007/s11882-020-00961-1

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

51.Муллол Дж., Мариньо-Санчес Ф., Вальс М., Алобид И., Марин С. Обоняние при хроническом риносинусите. J Allergy Clin Immunol. (2020) 145: 773–776. doi: 10.1016/j.jaci.2020.01.024

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

52. Lechner M, Chandrasekharan D, Jumani K, Liu J, Gane S, Lund VJ, et al. Аносмия как симптом инфекции SARS-CoV-2 у медицинских работников — систематический обзор литературы, серий случаев и рекомендаций по клинической оценке и лечению. Ринология. (2020) 58:394–9. doi: 10.4193/Rhin20.189

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

55. Биадси А., Биадси А., Кассем Ф., Даган О., Масарва С., Ормианер З. Обонятельные и оральные проявления COVID-19: связанные с полом симптомы — потенциальный путь к ранней диагностике. Отоларингол Head Neck Surg. (2020) 163:722–8. дои: 10.1177/0194599820934380

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

56.Эльхоли СМА, Абдельвахаб М.К., Абдельхафиз М. Влияние потери обоняния на качество жизни и принятые стратегии выживания у пациентов с COVID-19. Европейская Арка Ото-Рино-Ларингол . (2021). doi: 10.1007/s00405-020-06575-7. [Epub перед печатью].

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

57. Cooper KW, Brann DH, Farruggia MC, Bhutani S, Pellegrino R, Tsukahara T, et al. COVID-19 и химические чувства: поддержка игроков выходит на первый план. Нейрон. (2020) 107: 219–33. doi: 10.1016/j.neuron.2020.06.032

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

58. Jaggupilli A, Singh N, Upadhyaya J, Sikarwar AS, Arakawa M, Dakshinamurti S, et al. Анализ экспрессии рецепторов горького вкуса человека во внеротовых тканях. Mol Cell Biochem. (2017) 426:137–47. doi: 10.1007/s11010-016-2902-z

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

59. да Силва Педроса М., Сиперт Ч.Р., Ногейра Ф.Н.Измененный вкус у пациентов с COVID-19: потенциальная роль слюнных желез. Оральный дис . (2020). doi: 10.1111/odi.13496. [Epub перед печатью].

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

61. Моейн С.Т., Хашемян С.М., Мансурафшар Б., Хоррам-Туси А., Табарси П., Доти Р.Л. Дисфункция обоняния: биомаркер COVID-19. Int Forum Allergy Rhinol. (2020) 10: 944–50. doi: 10.1002/alr.22587

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

62.Song J, Deng Y-K, Wang H, Wang Z-C, Liao B, Ma J и др. Нарушения вкуса и обоняния, о которых сообщают сами пациенты с COVID-19: отличительные особенности в Китае. medRxiv [Препринт]. (2020). дои: 10.1101/2020.06.12.20128298

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

63. Абделалим А.А., Мохамади А.А., Эльсайед Р.А., Элавади М.А., Галлаб А.Ф. Назальный спрей с кортикостероидами для восстановления обоняния у пациентов с COVID-19: рандомизированное контролируемое исследование. Am J Отоларингол. (2021) 42:102884. doi: 10.1016/j.amjoto.2020.102884

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

64. Искьердо-Домингес А., Рохас-Лечуга М.Дж., Кьеза-Эстомба С., Кальво-Энрикес С., Нинкриц-Бесерра Э., Сориано-Рейшах М. и другие. Дисфункция обоняния и вкуса при COVID-19 связана с более молодым возрастом в амбулаторных условиях: многоцентровое перекрестное исследование. J Инвестиг Аллергол Клин Иммунол. (2020) 30:346–57. doi: 10.18176/jiaci.0595

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

65.Буске Дж., Акдис С., Ютель М., Бахерт С., Климек Л., Агаче И. и др. Интраназальные кортикостероиды при аллергическом рините у пациентов, инфицированных COVID-19: заявление ARIA-EAACI. Аллергия . (2020) 75:2440–4. дои: 10.1111/all14302

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

66. Zhang CZ, Cheng XQ, Li JY, Zhang P, Yi P, Xu X, et al. Слюна в диагностике заболеваний. Int J Oral Sci. (2016) 8:133–7. doi: 10.1038/ijos.2016.38

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

67.Сабино-Сильва Р., Жардим АКГ, Сикейра В.Л. Коронавирус COVID-19 влияет на стоматологию и потенциальную диагностику слюны. Клин Орал Инвест. (2020) 24:1619–21. doi: 10.1007/s00784-020-03248-x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

68. Liu L, Wei Q, Alvarez X, Wang H, Du Y, Zhu H, et al. Эпителиальные клетки, выстилающие протоки слюнных желез, являются ранними клетками-мишенями коронавирусной инфекции тяжелого острого респираторного синдрома в верхних дыхательных путях макак-резусов. Дж Вирол. (2011) 85:4025–30. doi: 10.1128/ОВИ.02292-10

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

69. Синджари Б., Д’Ардес Д., Сантилли М., Реджепи И., Д’Аддацио Г., Ди Карло П. и соавт. SARS-CoV-2 и оральные проявления: обсервационное исследование на людях. J Clin Med. (2020) 9:3218. дои: 10.3390/jcm18

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

70. Томсон В.М., Чалмерс Дж.М., Спенсер А.Дж., Уильямс С.М.Инвентаризация ксеростомии: комплексный подход к измерению сухости во рту. Сообщество Dent Health. (1999) 16:12–7.

Реферат PubMed | Академия Google

71. Mortazavi H, Baharvand M, Movahhedian A, Mohammadi M, Khodadoustan A. Ксеростомия вследствие системного заболевания: обзор 20 состояний и механизмов. Ann Med Health Sci Res. (2014) 4: 503–10. дои: 10.4103/2141-9248.139284

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

72.Spagnuolo G, De Vito D, Rengo S, Tatullo M. Вспышка COVID-19: обзор стоматологии. Int J Environ Res Общественное здравоохранение. (2020) 17:2794. doi: 10.3390/ijerph27062094

Полнотекстовая перекрестная ссылка

73. Кагетти М.Г., Кайроли Дж.Л., Сенна А., Кампус Г. Вспышка COVID-19 в Северной Италии: обзор стоматологии. Анкетный опрос. Int J Environ Res Общественное здравоохранение . (2020) 17:3835. doi: 10.3390/ijerph27113835

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

74.Мэн Л., Хуа Ф., Бьян З. Коронавирусная болезнь 2019 г. (COVID-19): возникающие и будущие проблемы для стоматологической и оральной медицины. Дж Дент Рез . (2020) 99:481–7. дои: 10.1177/00220345206

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

75. Ferrazzano GF, Ingenito A, Cantile T. Болезнь COVID-19 у детей: что стоматологи должны знать и делать, чтобы предотвратить распространение вируса. Итальянская точка зрения. Int J Environ Res Общественное здравоохранение . (2020) 17:3642. дои: 10.3390/Jerph27103642

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

76. Amorim Dos Santos J, Normando AGC, Carvalho da Silva RL, Acevedo AC, De Luca Canto G, Sugaya N, et al. Оральные проявления у пациентов с COVID-19: живой систематический обзор. Дж Дент Рез . (2021) 100:141–54. дои: 10.1177/0022034520957289

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

77. Амато А., Каджано М., Амато М., Мочча Г., Капунцо М., Де Каро Ф.Инфекционный контроль в стоматологической практике во время пандемии COVID-19. Int J Environ Res Общественное здравоохранение . (2020) 17:4769. doi: 10.3390/ijerph27134769

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

78. Capocasale G, Nocini R, Faccioni P, Donadello D, Bertossi D, Albanese M, et al. Как бороться с коронавирусной болезнью 2019: всесторонний описательный обзор о поражении полости рта заболеванием. Clin Exp Dent Res . (2021) 7:101–8. doi: 10.1002/cre2.332

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

79. Nuno-Gonzalez A, Martin-Carrillo P, Magaletsky K, Martin Rios MD, Herranz Mañas C, Artigas Almazan J, et al. Распространенность слизисто-кожных проявлений у 666 пациентов с COVID-19 в полевом госпитале в Испании: оральные и ладонно-подошвенные данные. Бр Дж Дерматол . (2021) 184:184–5. дои: 10.1111/bjd.19564

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

80. Атес А.А., Аломари Т., Бхардвадж А., Табндж А., Гамбарини Г.Различия в неотложной эндодонтической помощи эндодонтами и стоматологами общей практики во времена COVID-19. Браз Орал Рес . (2020) 34: e122. doi: 10.1590/1807-3107bor-2020.vol34.0122

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

81. Атер А., Патель Б., Рупарел Н.Б., Диоген А., Харгривз К.М. Коронавирусная болезнь 19 (COVID-19): последствия для клинической стоматологической помощи. J Endod. (2020) 46: 584–95. doi: 10.1016/j.joen.2020.03.008

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

83.Карруэль Ф., Вьенно С., Валетт М., Коэн Дж. М., Дюссарт С., Буржуа Д. Обнаружение вируса SARS-CoV-2 в слюне и носу после применения противовирусных ополаскивателей для рта (BBCovid): структурированное резюме протокола исследования для рандомизированного контролируемого исследования. Испытания . (2020) 21:906. doi: 10.1186/s13063-020-04846-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

84. Cavalcante-Leão BL, de Araujo CM, Basso IB, Schroder AG, Guariza-Filho O, Ravazzi GC, et al. Существуют ли научные доказательства эффективности ополаскивателей для снижения вирусной нагрузки при Covid-19? Систематический обзор. J Clin Exp Dent . (2021) 13:e179–89. doi: 10.4317/jced.57406

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

85. Умех О.Д., Утоми И.Л., Исиекве И.Г., Аладеника Э.Т. Влияние пандемии коронавирусной болезни 2019 года на ортодонтических пациентов и их отношение к ортодонтическому лечению. Am J Orthod Dentofacial Orthop . (2021). doi: 10.1016/j.ajodo.2020.11.030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

86.Каур Х., Кочхар А.С., Гупта Х., Сингх Г., Кубават А. Подходящие ортодонтические приспособления во время пандемии COVID-19: предварительный обзор. J Oral Biol Craniofac Res . (2020) 10: 782–7. doi: 10.1016/j.jobcr.2020.10.014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

88. Михайлиду Э., Пулопулос А., Цимагиоргис Г. Диагностика слюны нового коронавируса SARS-CoV-2 (COVID-19). Оральный дис . (2020). doi: 10.1111/odi.13729. [Epub перед печатью].

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

89. To KKW, Chan KH, Ho J, Pang PKP, Ho DTY, Chang ACH и др. Респираторная вирусная инфекция среди госпитализированных взрослых пациентов с клинически выраженной респираторной инфекцией или без нее: проспективное когортное исследование. Clin Microbiol Infect. (2019) 25:1539–45. doi: 10.1016/j.cmi.2019.04.012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

90. Европейский центр профилактики и контроля заболеваний A.a.o.t.E.U. Обновление ситуации с COVID-19 . Сольна (2020).

91. Организация WH. Коронавирусная болезнь (COVID-19) Рекомендации для населения . Женева (2020).

Академия Google

92. Канада. Коронавирусная болезнь (COVID-19): меры по снижению заболеваемости COVID-19 в вашем сообществе . Оттава, Онтарио (2020 г.).

94. Ассоциация АД. Неотложная стоматологическая помощь COVID19 (2020 г.).

95. Питонес-Рубио В., Чавес-Кортес Э.Г., Уртадо-Камарена А., Гонсалес-Раскон А., Серафин-Игера Н.Является ли заболевание пародонта фактором риска тяжелого течения COVID-19? Мед Гипотеза. (2020) 144:109969. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109969

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

97. Самаранаяке Л.П., Рейд Дж., Эванс Д. Эффективность изоляции коффердамом в снижении атмосферного бактериального загрязнения. ASDC J Дент Чайлд. (1989) 56:442–4.

Реферат PubMed | Академия Google

98. Seneviratne CJ, Balan P, Ko KKK, Udawatte NS, Lai D, Ng DHL, et al.Эффективность коммерческих ополаскивателей для рта в отношении вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в слюне: рандомизированное контрольное исследование в Сингапуре. Инфекция. (2020). doi: 10.1007/s15010-020-01563-9. [Epub перед печатью].

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

99. Marui VC, Souto MLS, Rovai ES, Romito GA, Chambrone L, Pannuti CM. Эффективность предпроцедурных ополаскивателей для полости рта в уменьшении количества микроорганизмов в аэрозоле: систематический обзор. J Am Dental Assoc. (2019) 150:1015–1026.е1. doi: 10.1016/j.adaj.2019.06.024

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

101. Дай Л., Гао Г.Ф. Вирусные мишени для вакцин против COVID-19, обзоры Nature. Иммунология. (2021) 21:73–82. doi: 10.1038/s41577-020-00480-0

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Орофациальные болевые состояния. Боли и слизистая оболочка полости рта

Местные или системные кортикостероиды

Кожно-слизистые заболевания

Красный плоский лишай (22,23)(см.1)

Поражения, вызванные красным плоским лишаем полости рта (OLP) часто присутствуют двусторонне и обычно видны на слизистой оболочке щек, язык и десны. Существует 6 типов: ретикулярный, эрозивно-язвенный, папулезный, бляшковидный и буллезный ОЛП. Они могут присутствовать одновременно. ретикулярный тип является наиболее распространенным и, как правило, бессимптомным, тогда как эрозивно-язвенные типы часто сопровождаются жжением, колющая боль.

Кальцинейрин ингибиторы Слабые доказательства в отношении облегчения боли: местный такромилус и пимекролимусЦиклоспорин для местного примененияАлоэ вера для местного применения

Вульгарная пузырчатка (24)

Аутоиммунное заболевание с отложение в основном антител класса IgG межклеточно, а также как повреждение десмосом антителами, направленными против внеклеточного домены молекул адгезии эпителиальных клеток кадгеринового типа, особенно десмоглеина 3, что приводит к множественным язвам и эрозиям, которым предшествуют буллы, преимущественно на мягком небе и слизистой оболочке щек.

Системное лечение, включая кортикостероиды, иммуноглобулины, ритуксимаб, микофенолата мофетил, метотрексат, азатиоприн и циклофосфамид

Пемфигоид слизистых оболочек (25)

Острый или хронический аутоиммунный заболевание, возникающее вследствие реакции на базальную мембрану эпителия, вызывает шелушение и изъязвление слизистой оболочки полости рта. Самый распространенный местами поражения ротовой полости являются десна (94 %), небо (32 %), слизистая оболочка щек (29 %), дно рта (5 %) и язык (5 %).

Топические стероиды, такие как клобетазолСистемный преднизолон Другие иммуносупрессивные средства, в т.ч. метотрексат, азатиоприн, может быть показан микофенолата мофетил. Антибиотики, т.е. тетрациклин или эритромицин для контроля вторичных инфекций

Многоформная эритема (26)

Острое начало; обширный, нерегулярный и чрезвычайно болезненные участки изъязвлений с желтым основанием и эритематозные границы на слизистой оболочке щек, неба, дорсальной и вентральной поверхности языка.Часто вовлекаются губы, демонстрируя обширные изъязвления неправильной формы, трещины и трещины с кровяными корками. Эритема. multiforme обычно вызывается инфекциями простого герпеса, и иногда при приеме наркотиков.

Идентификация срабатывания агент. При инфицировании ВПГ противовирусная терапия. Если это побочное действие препарата. реакции препарат немедленно отменяют. Паллиативное лечение: анальгетики, вязкие полоскания лидокаином, успокаивающие полоскания рта, мягкие диета, отказ от кислой и острой пищи, системные или местные антибиотики предотвратить вторичное инфицирование; системные или местные кортикостероиды в тяжелых случаях

Красная волчанка(25)

Эритематозные и язвенные поражения с белыми полосами, расходящимися от центра, на щечной и слизистая оболочка губ, десна и киноварь.Поражения также могут быть белыми. или красные пятна или буллезный.

Системные или местные кортикостероидыСистемные иммунодепрессанты

Ятрогенный условия

Оральный трансплантат против хозяинаБолезнь (27)

Характеризуется лихеноидом, папулезные и эритематозные поражения, иногда изъязвления и шелушение слизистой оболочки щек и губ, неба и спины часть языка.Поражения полости рта часто сопровождаются лихорадкой, недомоганием, тошнота и ксеростомия. Оральные находки могут быть вызваны комбинацией лучевая терапия, химиотерапия, иммуносупрессивные препараты и вторичные инфекции.

Системные иммунодепрессанты

Мукозит полости рта (28)

Состояние, которое может возникнуть в пациенты, получающие высокодозную химиотерапию и/или лучевую терапию к раку головы и шеи с вовлечением полости рта.Оральный мукозит относится к эритематозно-язвенным поражениям слизистой оболочки полости рта. Поражения часто очень болезненны и нарушают питание и пероральный прием. гигиене, а также повышают риск местных и системных инфекций. состояние также может сопровождаться нарушением вкуса и ксеростомией. Острый мукозит может перейти в хронический мукозит.

Паллиативное лечение: техническое обслуживание достаточной гигиены полости ртаВыпейте большое количество водыАнальгетики, вязкие ополаскиватели с лидокаиномСмазывающие, успокаивающие ополаскиватели/гели для полости ртаSoft Diet, отказ от алкоголя, кислой и острой пищи; системных или местных антибиотиков. (антибактериальное, противовирусное и противогрибковое лечение)

Лекарственные реакции (26)

Часто обширные изъязвления неправильной формы различной глубины, чаще всего на слизистой оболочке щеки и деснах.Эрозии а также могут присутствовать пузырчатые и лихеноидные поражения.

Прекращение использования противодействующего лекарства, это могут быть НПВП, пеницилламин, пиразолон; антигипертензивные как каптоприл и бета-блокаторы; антибиотики напр. пенициллин, рифампин и цефалексин; барбитураты и гормоны. Актуальные стероиды для усиления исцеление

Синдром оральной аллергии и контактный аллергия (29)

Синдром оральной аллергии (ОАС) обычно возникает у пациентов с аллергией на пыльцу деревьев, травы или сорняки.Свежие фрукты, сырые овощи и сырые орехи распространены причины ОАС. Симптомы, включая зуд и/или отек всех или части губ, языка, рта или горла, но это может в некоторых случаях быть серьезными, а также включать тошноту и рвоту. материалы, средства гигиены полости рта и пищевые добавки могут вызвать контакт аллергические реакции во рту с различной клинической картиной включая стоматит, лихеноидные поражения, эрозии, волдыри и изъязвления.

Избегание аллергенов.Удостоверение личности причины аллергии с помощью патч-теста. Системные или местные кортикостероидыАнтигистамин

местный заболевания слизистых оболочек

Рецидивирующий афтозный стоматит (РАН) (30)

РАС характеризуется рецидивирующим приступы одиночных или множественных неглубоких болезненных язв с эритематозным границы, с интервалом от нескольких месяцев до нескольких дней. Язвы чаще всего обычно наблюдается на неороговевающих поверхностях слизистой оболочки, таких как губные слизистая оболочка, слизистая оболочка щек и дна полости рта.Язвы могут быть 2- 5 мм в диаметре (небольшой РАС), > 10 мм (большой РАС) или герпетиформный (язвы 2-4 мм, расположенные в зобах)

Возможная системная ассоциация при РАС необходимо исключить, особенно в случаях внезапного развития РАН у взрослых Ополаскиватель для рта с хлоргексидином Топические стероиды и системный преднизолон в тяжелых случаях Тетрациклин суспензия для приема внутрь

Географический язык (31) (см. 2)

Круглые эритематозные участки, часто резко очерчены приподнятыми беловатыми пограничными зонами, расположенными на боковой, дорсальной, передней и/или вентральной частях языка Эритематозный вид возникает из-за атрофии и утраты нитевидных поражения сосочков Около 30 % испытывают дискомфорт во рту, жжение и покалывание ощущение на языке

Лечение симптоматическое: Бензидамин гидрохлоридУспокаивающий ополаскиватель для ртаТопические стероиды в тяжелых случаях

Травматические язвы

В любом месте на слизистой оболочке полости ртаЛокализованно язвы с красными краями, образовавшиеся в результате случайного прикусывания слизистой оболочки полости рта, проникновение инородного предмета или раздражение реставрацией зубного протеза ортодонтические накладки

Устранение причины Исцеление через 7 — 10 дней, если нет вторичного заражения

Воспалительные заболевания кишечника

Болезнь Крона (32)

Мультифокальные, линейные, узловатые, или диффузные утолщения слизистой оболочки, наблюдаемые на слизистой оболочке губ и щек, и слизисто-щечные складки.Они могут быть связаны с (постоянным) изъязвления. Афтозноподобные изъязвления и атрофический глоссит

Системное лечение иммунодепрессантами. Некоторые язвенные поражения полости рта могут потребовать местной терапии кортикостероидами или внутриочаговые инъекции кортикостероидов.

Язвенный колит (32)

Разбросанные, сгруппированные или линейные ориентированные пустулы на эритематозной слизистой оболочке в нескольких местах полости рта. у пациентов в дополнение к гнойничковым поражениям полости рта обнаруживаются афтозные поражения. поражения.

Поражения полости рта обычно реагируют к системному лечению. Актуальные или системные кортикостероиды и дапсон применялся при резистентных поражениях полости рта с различной эффективностью.

Целиакия (33)

Часто встречаются афтозные язвыМальабсорбция железа и витамина В может вызвать чувство жжения и покалывания в язык.

Безглютеновая диета Афтозная поражения обычно исчезают или улучшаются у пациентов, которые придерживаются безглютеновая диета

Минерал и дефицит витаминов

Дефицит железа Витамин B 12 и дефицит фолиевой кислоты (32)

Атрофический глоссит, при котором нитевидный сосочек спинки языка подвергается атрофии, оставляя гладкий, эритематозный язык.Другие участки слизистой оболочки полости рта также могут быть атрофическими и красными. Часто встречаются афтозные язвы. в тяжелых случаях. Клинически может предшествовать чувство жжения, покалывания. обнаруживаемые поражения полости рта Тяжелые случаи витамина B12 также могут быть связаны с парестезиями. Предрасположенность к развитию ангулярного хейлита.

Дефицит железа и витамина B12 и фолиевой кислоты часто возникают из-за мальабсорбции при желудочно-кишечных заболеваниях или из-за пернициозной анемии. Оральные проявления часто реагируют на адекватной заместительной терапии.В тяжелых случаях витамина B12, парестезии могут сохраняться.

Поражения слизистой оболочки полости рта при инфекции SARS-CoV-2: серия случаев и обзор литературы | The Egypt Journal of Otolaryngology

Несмотря на описание нескольких проявлений SARS-CoV 2 [12] в литературе, некоторые проявления до сих пор не описаны или не полностью подтверждены.

Основными путями передачи являются прямые, такие как кашель, чихание и микрокапли слюны во время разговора, или косвенные, при взаимодействии со слизистыми оболочками в организме, такими как слизистые оболочки ротоглотки, придаточных пазух носа и глаз [13, 14].

Описаны поражения полости рта в виде двух бессимптомных эритематозных депапиллярных участков на передней трети языка, еще одного поражения в виде болезненной трещины на верхней губе и язвы на боковой стенке ротоглотки. Является ли это прямым проявлением COVID-19 или лекарственной реакцией, или вторичной грибковой инфекцией, доподлинно выяснить не удалось. Однако реакция на лекарство менее вероятна, поскольку состояние улучшилось без прекращения приема каких-либо препаратов.

На сегодняшний день было описано несколько типов поражений полости рта у пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19.Наиболее частыми локализациями поражений ротоглотки были язык, слизистая оболочка губ, небо, десна, слизистая оболочка щек, ротоглотка и миндалины; (38%), (26%), (22%), (8%), (5%), (4%), (1%) соответственно. Шестьдесят восемь процентов поражений были симптоматическими (болезненными или зудящими). Оба пола были почти равны по частоте поражений слизистой оболочки полости рта, а время заживления составляло от 3 до 28 дней после появления [15].

Каррерас-Пресас и др. описали три случая везикуло-буллезных поражений слизистой оболочки полости рта у пациентов с SARS-CoV 2 [9].Поражения были в виде волдырей или болезненных язв. Все вылечились и исчезли через 3–10 дней. Авторы утверждали, что боль может быть связана с более высокой экспрессией ACE2 в поверхностных клетках слизистой оболочки языка по сравнению со слизистой оболочкой десен или щек [16].

Брандао и др. сообщили о восьми случаях инфекции SARS-CoV 2 с афтозными изъязвлениями, поражающими язык, губы, небо и ротоглотку. Они обнаружили, что эволюция поражений полости рта и заживление соответствовали разрешению инфекции COVID-19 [6].

Малих и др. сообщили о 38-летнем пациенте с воспалением гортани с афтозной язвой на левой миндалине [17]. Каммерер и др. сообщил о 46-летнем пациенте с несколькими хорошо очерченными язвами, покрытыми серой пленкой, в полости рта.

Они обнаружили повышенный уровень интерлейкина 6, положительные антитела к вирусу простого герпеса (ВПГ) (IgM) и положительный результат ПЦР на ВПГ; следовательно, они предположили, что это связано с герпетическим стоматитом [18]. Хотя Домингес-Сантас и соавт. сообщили о четырех случаях с небольшими афтозными изъязвлениями на губах, слизистой оболочке щек, языке и ротоглотке.Они обнаружили отрицательный результат ПЦР на ВПГ вместе с отрицательной сывороткой на сифилис, ВИЧ, ВЭБ, ЦМВ, ВГВ и ВГС. Так они объяснили язвы из-за цитокинового шторма инфекцией COVID-19 [19].

Родригес и др. сообщили о трех случаях с афтозными язвами, жжением, депапиляцией слизистой оболочки языка и ангулярным хейлитом [20]. Кроме того, Томо и соавт. сообщили о случае 37-летней женщины с болезненной эритематозной депапиляцией латеральной границы языка, которая зажила в течение двух недель. Они объяснили это мукозитом из-за повышенной чувствительности к COVID-19 [21].

Кроме того, Chaux-Bodard et al. [22] опубликовали случай язвы языка у 45-летней пациентки. Обратилась в течение 1-х суток с появлением болезненного поражения слизистой языка с последующим появлением красного пятна, которое переросло в бессимптомную язву неправильной формы. Через десять дней язва полностью зажила без рубца.

Главина и др. опубликовали случай поражения слизистой оболочки полости рта у 40-летнего пациента с рецидивирующим ВПГ твердого неба, а на вентральной поверхности языка имелись неспецифические белые поражения с агезией.Больному проводилась системная противовирусная терапия (ацикловир) и местное лечение (местные противогрибковые препараты, нистатин и местный анестетик) в течение 14 дней. Больной полностью выздоровел через 21 день. По их мнению, острая агевзия связана с SARS-CoV-2. В то время как рецидивы ВПГ слизистой оболочки твердого неба были вызваны стрессом, вызванным SARS-CoV-2, и поэтому, вероятно, являются вторичным симптомом слабой иммунной системы хозяина [23].

Tapia и др. сообщили о четырех пациентах с геморрагическими поражениями и стоматитом.Они предположили, что поражения были вызваны образованием тромбов и васкулитом из-за болезни COVID-19 [24].

Томо и др. описал случай 37-летней женщины с лихорадкой, изменением вкуса и аносмией. Инфекция COVID-19 была подтверждена методом ПЦР. Выполнена депапилляция краев языка с разлитой эритемой, назначены полоскания рта хлоргексидином 0,12%. Пациент был бессимптомным через 2 недели [21].

Ciccarese et al. сообщила, что 19-летняя женщина жаловалась на лихорадку, боль в горле, изменение обоняния и бессимптомные поражения кожи и полости рта.Физикальное обследование выявило множественные язвы, сгустки крови на губах и петехии на небе и деснах. Через десять дней поражения кожи и слизистых оболочек исчезли [25].

Ансари и др. описал два случая, 56-летняя женщина жаловалась на лихорадку и одышку. Через 5 дней появились язвы во рту. на осмотре; в полости рта (твердое небо) обнаружено несколько язв разного размера и с неровными краями. Во втором случае 75-летний мужчина жаловался на дисфазию. Они обнаружили множественные красные болезненные язвы на ротовой полости языка.Они взяли биопсию поражений у обоих пациентов, которые выявили диффузный отек, эрозии слизистой оболочки и подслизистые грануляции [26].

Соареш и др. описал случай 42-летнего пациента с лихорадкой, кашлем, стеснением в груди, кожными петехиями и жгучими язвами на слизистой оболочке щек. При осмотре было обнаружено несколько эритематозных пятен разного размера на твердом небе, языке и губах. Поражения слизистой оболочки полости рта исчезли через три недели. Биопсия из язв показала подслизистую инфильтрацию с хроническими воспалительными клетками наряду с некротическими участками и тромбами, закупоривающими кровеносные сосуды.Отрицательные иммуногистохимические реакции на распространенные вирусы, вызывающие язвы: ВГЧ-1, ВГЧ-2, ЦМВ, бледная трепонема и ВЭБ. Они считают, что поражения слизистой оболочки могут быть связаны с тромботической васкулопатией COVID-19 [27].

Jimenez-Cauhe et al. опубликовали три случая с жалобами на пятна и петехии на слизистой оболочке неба вместе с поражениями кожи. Системные стероиды назначались с полным выздоровлением в течение 2–3 нед [28].

Аморим и др. в своем исследовании пришли к выводу, что нет четких доказательств этиопатологической связи между поражениями слизистой оболочки полости рта и SARS-CoV 2.Клинические ассоциации указывают на нарушение иммунитета, побочные эффекты лекарств и коинфекции, а не на первичную этиологию слизистой оболочки полости рта, вызванную SARS-CoV-2 [29],

Полость рта является точкой входа для различных микроорганизмов, включая SARS -CoV-2, который может быть обнаружен в слюне пациентов, инфицированных COVID-19, что позволяет предположить, что выделение вируса в слюне связано с симптомами заболевания [30].

Эти поражения слизистой оболочки полости рта развиваются одновременно с гипосмией/агевзией или спустя 14 дней.Интересно, что заживление этих поражений слизистой оболочки происходит в соответствии с разрешением инфекции SARS-CoV 2, что может представлять собой связь между вирусной инфекцией, поражениями полости рта и их исчезновением [31].

Проявления COVID-19 связывают с этиологическими факторами, включающими «цитокиновую бурю», вызванную избыточной продукцией провоспалительных цитокинов в результате дисфункциональной иммунной реакции [32]. Кроме того, было высказано предположение, что провоспалительные цитокины воспаленной десны, такие как IL-1β и TNF-α, могут проникать в слюну [32, 33].

Хотя причинно-следственная связь между инфекцией SARS-Cov 2 и поражением слизистой оболочки полости рта не может быть установлена. Существует множество переменных, которые могут спровоцировать поражение слизистой оболочки полости рта, такие как стресс, вызванный ограничениями социальной жизни во время изоляции, проблемы с гигиеной полости рта [34], вирус простого герпеса, глоссит, кандидоз полости рта, лекарственные реакции, аутоиммунные расстройства и дефицит питания. [16].

A20 управляет воспалительной реакцией слизистой оболочки полости рта за счет ограничения активности NF-κB

Abstract

Нарушение регуляции иммунного ответа на дисбиотическую резидентную микрофлору полости рта приводит к хроническому периодонтальному заболеванию, местной деструкции тканей и различным системным осложнениям.Для сохранения тканевого гомеостаза необходимо жестко регулировать воспалительные сигнальные пути, участвующие в прогрессировании пародонтита. A20 (TNFAIP3), фермент, редактирующий убиквитин, стал одним из ключевых регуляторов воспаления. Тем не менее, функция A20 в слизистой оболочке полости рта и биологические пути, с помощью которых A20 смягчает воспаление пародонта, остаются неясными. Используя комбинацию моделей заболеваний in vivo и ex vivo, мы сообщаем в этом исследовании, что A20 регулирует воспалительные реакции на краеугольную оральную бактерию, Porphyromonas gingivalis , и сдерживает воспаление пародонта за счет своего влияния на передачу сигналов NF-κB и продукцию цитокинов.Истощение A20 с помощью редактирования генов в макрофагоподобных клетках человека (THP-1) значительно увеличивало секрецию цитокинов, тогда как избыточная экспрессия A20 с использованием лентивирусной инфекции ослабляла продукцию цитокинов после бактериального заражения посредством модулирования активности NF-κB. Подобно клеткам человека, макрофаги, полученные из костного мозга мышей с дефицитом A20, инфицированных P. gingivalis , демонстрировали повышенную активность NF-κB и продукцию цитокинов по сравнению с клетками, выделенными из A20-компетентных мышей.Последующие эксперименты с использованием мышиной модели пародонтита, вызванного лигатурой, показали, что даже частичная потеря А20 способствует усилению воспалительного фенотипа и более серьезной потере костной ткани, что еще раз подтвердило критическую функцию А20 в слизистой оболочке полости рта. В совокупности, насколько нам известно, эти результаты раскрывают первые систематические доказательства физиологической роли A20 в поддержании гомеостаза тканей полости рта в качестве негативного регулятора воспаления.

Введение

Полость рта является домом для разнообразной группы микробиоты, включая более 700 видов бактерий, грибков и вирусов, и служит воротами между окружающей средой и организмом (1).Ткани десны используют сложную иммунную систему для защиты хозяина от постоянного микробного поражения и внешнего стресса и поддерживают тонкий баланс между иммунным ответом хозяина и резидентной микробиотой полости рта для поддержания гомеостаза тканей (2). Как и в других тканях, инициирование воспаления в слизистой оболочке полости рта в основном обусловлено TLRs и сигнальным каскадом NF-κB. В частности, взаимодействие TLR2, TLR4 и TLR9 с молекулярными паттернами, ассоциированными с микроорганизмами полости рта, запускает выработку воспалительных цитокинов/хемокинов и металлопротеаз, повреждающих ткани, путем задействования адаптера MyD88 для активации киназы, ассоциированной с рецептором IL-1 (IRAK), TNF. комплексы рецептор-ассоциированный фактор 6 (TRAF6) и TGF β-активируемая киназа 1 (TAK1), которые впоследствии приводят к деградации IκB и ядерной транслокации NF-κB (2, 3).Инициация воспаления через передачу сигналов NF-κB и последующее высвобождение провоспалительных цитокинов, безусловно, защищают от постоянной микробной провокации, тогда как невозможность своевременного прекращения иммунного ответа приводит к неустойчивому воспалению, нарушению тканевого гомеостаза и последующему заболеванию пародонта (1, 2).

Пародонтит — одно из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний, поражающее почти половину взрослого населения и характеризующееся разрушением альвеолярного отростка и потерей зубов (4).Персистирующие формы заболевания также связаны с несколькими системными состояниями, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания, рак, неблагоприятные исходы беременности и ревматоидный артрит (5–8). Предотвращение неблагоприятных клинических исходов в местных и отдаленных тканях требует тщательного понимания взаимодействий между различными компонентами иммунной системы хозяина друг с другом и резидентным микробиомом полости рта, а также определения ключевых регуляторных путей, участвующих в поддержании гомеостаза слизистой оболочки полости рта.В связи с этим, хотя биологические пути, инициирующие воспалительные реакции в слизистой оболочке полости рта, относительно хорошо изучены, в наших знаниях о нижестоящих регуляторных путях, функционирующих для прекращения воспаления пародонта, все еще имеются пробелы.

Сигнальный путь NF-κB в значительной степени регулируется убиквитинированием, которое является обратимой посттрансляционной модификацией, которая может прекращать передачу клеточных сигналов посредством протеасом-опосредованной деградации и/или препятствовать переносу белков посредством активации киназ и фосфатаз (9).Хотя убиквитин и родственные убиквитину молекулы привлекают внимание как регуляторы множества биологических путей в патофизиологии многочисленных хронических воспалительных состояний, мы до сих пор мало знаем об их функции в слизистой оболочке полости рта (10). A20, также известный как индуцируемый TNF-α белок 3 (TNFAIP3), представляет собой фермент, редактирующий убиквитин, и недавно стал важным негативным регулятором воспаления посредством прекращения активации NF-κB в рамках петли отрицательной обратной связи (11).A20 состоит из двух функциональных доменов, в том числе N-концевого домена опухоли яичника с деубиквитинирующей активностью и C-конца с семью доменами цинковых пальцев, которые поддерживают активность убиквитинлигазы E3. A20 активируется после NF-kB и препятствует убиквитинированию нескольких субстратов, таких как TRAF6, эссенциальный модулятор NF-kB (NEMO) и взаимодействующая с рецептором серин/треонин-протеинкиназа 1 (RIP), впоследствии ограничивая воспаление, вызванное активация многочисленных иммунных сенсоров, таких как TLR и рецепторы, подобные домену олигомеризации, связывающему нуклеотиды, TNFR, IL-1R и IL-17R (11–15).Эти сигнальные пути также вовлечены в патофизиологию заболеваний пародонта. Подтверждая свою существенную роль в сдерживании воспаления, у мышей с нокаутом A20 ( A20 -/- ) развивается спонтанное мультиорганное воспаление, и они погибают в течение 3-4 недель после рождения (16). Нарушение функции или дефицит A20 связано с неустойчивым воспалением и повреждением тканей при нескольких моделях заболеваний, включая аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит, желудочно-кишечные и печеночные расстройства, кистозный фиброз, старение, рак и псориаз (17–25).Примечательно, что большинство заболеваний, связанных с A20, имеют общую патофизиологию с пародонтитом, и вполне вероятно, что A20 также действует как привратник воспаления на границе раздела хозяин-микробиом в слизистой оболочке полости рта. Действительно, в нашем предыдущем исследовании сообщалось об экспрессии A20 в слизистой оболочке полости рта и было обнаружено, что A20 является потенциальным регулятором воспаления периодонта после передачи сигналов TLR (26). Клинические данные также свидетельствуют о том, что уровни белка A20 могут не поддерживаться в течение пародонтита для сдерживания воспаления (26).Тем не менее, функция A20 в слизистой оболочке полости рта и биологические пути, с помощью которых A20 смягчает воспаление пародонта, остаются неясными. Поэтому в этом исследовании мы стремимся охарактеризовать роль A20 в регуляции воспалительных реакций в слизистой оболочке полости рта, уделяя особое внимание клеточной функции макрофагов, управляемой A20, с использованием установленных доклинических моделей заболеваний пародонта. Porphyromonas gingivalis , одна из основных пародонтальных бактерий, может активировать передачу сигналов NF-κB в макрофагах и индуцировать экспрессию A20 in vivo при введении в брюшную полость мышей, и, следовательно, она включена в качестве модели оральных бактерий в анализы in vitro. (26).Наши результаты показали, что A20 ингибирует выработку провоспалительных цитокинов как в макрофагах человека, так и мыши, инфицированных P. gingivalis , благодаря своему влиянию на передачу сигналов NF-κB. В соответствии с данными in vitro, мыши с частичной потерей A20 ( A20 +/- ) демонстрировали повышенный воспалительный фенотип, измеряемый повышенной потерей костной массы и экспрессией воспалительных цитокинов десен по сравнению с A20-компетентными мышами ( A20 ). +/+ ) мышей после индукции периодонтита.В совокупности, насколько нам известно, наши результаты представляют первые систематические доказательства и устанавливают новую физиологическую роль A20 в слизистой оболочке полости рта как регулятора воспаления.

Материалы и методы

Бактерии

P. gingivalis (штамм ATCC33277) содержали в анаэробных камерах с настоем сердечно-мозгового бульона с добавлением 0,5% (масс./об.) дрожжевого экстракта, 5 г/мл гемина, 0,5 г/ мл витамина К и 0,1% (масса/объем) цистеина. Бактерии уничтожали нагреванием при 80°С в течение 10 мин и подтверждали посевом на чашки с агаром.(26)

Выделение макрофагов костного мозга

Макрофаги костного мозга (BMDM) выделяли из бедренной и большеберцовой кости мышей в возрасте 4–8 недель в соответствии со стандартным протоколом с небольшими изменениями (27). Вкратце, бедренные и большеберцовые кости выделяли, а костный мозг промывали средой RPMI 1640. Эритроциты удаляли буфером для лизиса ACK (Quality Biological). Затем подсчитывали клетки костного мозга и высевали в чашку Петри диаметром 10 см с плотностью 2×10 6 клеток на чашку в среде DMEM с супернатантом L929 (глутамин, 4.5 г/л глюкозы, 100 мг/л пирувата натрия, 10% FCS, 0,05 мМ меркаптоэтанола и 25% супернатанта клеток L929 [Американская коллекция типовых культур; ККЛ-1]). Клетки собирали на 6-й день и пересевали в 12-луночные планшеты с плотностью 2×10 6 клеток на лунку DMEM без супернатанта L929 (глутамин, 4,5 г/л глюкозы, 100 мг/л пирувата натрия, 10% FCS). и 0,05 мМ меркаптоэтанола) и использовали для экспериментов.

Культура клеток и иммуноферментный анализ

Клетки HEK293T поддерживали в среде DMEM (Life Technologies).Клетки THP-1 поддерживали в среде RPMI 1640 (Life Technologies). Клетки THP-1 обрабатывали 25 нг/мл ФМА в течение ночи для дифференцировки в макрофаги. Супернатанты клеточных культур от THP-1 или BMDM собирали после инфицирования P. gingivalis (множественность инфекции 100 [MOI]) в разные моменты времени и анализировали с использованием IL-6/TNF ELISA человека или мыши Ready-SET-Go! Kit (eBioscience), соответственно руководству пользователя; каждый эксперимент проводили как минимум трижды независимо друг от друга в трех или четырех повторностях.Планшеты считывали при 450 нм с помощью Multiskan MCC (Thermo Fisher Scientific).

Исследования на животных

Все исследования на мышах были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Содружества Вирджинии. A20 +/- мышей фоновой линии C57BL/6 были любезно предоставлены Averil Ma (Калифорнийский университет, Сан-Франциско). Мышей C57BL/6 A20 +/- скрещивали для получения мышей A20 +/+ и A20 +/- .Для анализа генотипа потомства образцы геномной ДНК, выделенные из ушей мышей, были генотипированы на основе ранее описанного метода (28). Мышей с разными генотипами (дикий тип [WT] и гетерозиготы HET- A20 +/- ) исследовали в возрасте 10–12 недель. Во все эксперименты были включены животные, сопоставимые по возрасту и полу. Используемые животные принадлежали к одним пометам и находились в совместном размещении.

Конструирование плазмиды

Конструирование плазмиды проводили в соответствии со стандартными протоколами молекулярного клонирования.Вкратце, плазмидную ДНК pCDH-GFP расщепляли с помощью NotI (New England Biolabs) и XbaI (New England Biolabs). Фрагменты ПЦР A20 амплифицировали с прямым праймером (5′-TGCTCTAGAATGGATTACAAGGATGACGAC-3′) и обратным праймером (5′-TTTGCGGCCGCTTAGCCATACATCTGCTTGAAC-3′) с матрицей pCMV-Tag2-Flag-A20 (подарок от доктора А. Ма) с использованием системы ПЦР Expand Long Template (Roche) в соответствии с руководством пользователя. Фрагменты плазмиды продукта ПЦР лигировали с помощью ДНК-лигазы Т4 (New England Biolabs). Колонии с правильной вставкой были секвенированы, и вставки были подтверждены Национальным центром биотехнологической информации.lentiCRISPR v2 был подарен Feng Zhang (плазмида № 52961; Addgene). Последовательность однонаправленной РНК (sgRNA) была определена в соответствии с рекомендациями лаборатории Zhang, а плазмидные векторы были сконструированы в соответствии с протоколом, предоставленным лабораторией Zhang (29). Вкратце, синтетические олигонуклеотиды ДНК (последовательность sgRNA: 5′-TTCCAGTGTGTATCG GTGCA-3′) лигировали с вектором, расщепленным с помощью BsmBI (Fermentas Life Sciences), и трансформировали в One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli (Invitrogen).Последовательности были подтверждены Национальным центром биотехнологической информации. pRSV-Rev (плазмида № 12253; Addgene), pMDLg/pRRE (плазмида № 12251; Addgene) и pMD2.G (плазмида № 12259; Addgene) были подарены проф. Дидье Троно (Федеральная политехническая школа Лозанны, Лозанна, Швейцария).

Препарат лентивируса и инфицирование клеток THP-1

Клетки HEK293T высевали с плотностью 1 × 10 6 клеток на 10-см чашку и трансфицировали pRSV-Rev, pMDLg/pRRE, pMD2.G и плазмиды pCDH-GFP или pCDH-A20 (для сверхэкспрессии), или lentiCRISPR-sgRNA, или пустой вектор (lentiCRISPR v2) (для нокдауна A20). Через сорок восемь часов после трансфекции среду собирали и инкубировали с клетками THP-1 (1×10 5 ) в течение примерно 12 часов. Через 24 часа после инфицирования клетки отбирали с помощью пуромицина (1 мкг/мл) и объединяли для использования в ELISA и Вестерн-блоттинге.

Количественная ПЦР в реальном времени

РНК получали с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) с QIAcube (QIAGEN).Концентрации РНК определяли с помощью NanoDrop, и 800 нг общей РНК использовали для синтеза кДНК с помощью набора для обратной транскрипции кДНК High Capacity (Applied Biosystems) в соответствии с руководством пользователя. Количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили на Applied Biosystems 7500 с использованием SYBR Green Master Mix (SABiosciences). Праймеры, использованные для qRT-PCR, были следующими: прямой hGAPDH: 5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′, обратный hGAPDH: 5′-TTGATTTTG GAGGGATCTCG-3′; hA20 прямой: 5′-TTGTCTCAGTTTCGGGAG AT-3′, hA20 обратный: 5′-ACTTCTCGACACCAGTTGAGTT-3′; mGAPDH прямой: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, mGAPDH обратный: 5′-GGGGTCGTTGATGGCA ACA-3′; mIL-6 прямой: 5′-TCTATACCACTTCACAAGTC GGA-3′, mIL-6 обратный: 5′-GAAT TGCCATTGCACAACTCTTT-3′; mTNF прямой: 5′-CTGAACTTCGGGGTGAT CGG-3′, mTNF обратный: 5′-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′; mIL-17 прямой: 5′-GGCCCTCAGACTACCTCAAC-3′, mIL-17 обратный: 5′-TCTCGACCCTGAAAGTGA AGG-3′; и mIL-23 в прямом направлении: 5′-AATAATGTGCCCCGTATCCAGT-3′, mIL-23 в обратном направлении: 5′-GCTCCCCTTTGAAGATGTCAG-3′.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг проводили по стандартному протоколу с небольшими изменениями (26). Вкратце, клетки собирали и промывали предварительно охлажденным PBS с последующим лизисом буфером RIPA (Bio-Rad Laboratories) или буфером для загрузки 1× SDS. Концентрации белка определяли с помощью набора для анализа белка Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Затем образцы загружали в готовые белковые гели Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad Laboratories) и проводили электрофорез.Затем гели переносили на мембраны PVDF (Millipore) с последующей инкубацией Ab в соответствии с инструкциями пользователя. Использовали следующие антитела: антитело к TNFAIP3 (A20) (D13h4, 5630S, 1:1000; Cell Signaling Technology), антитело к β-актину (C4, sc-47778, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology), антитела к β-тубулину (D-10, SC-5274, 1:500; Santa Cruz Biotechnology), антитела к ингибитору NF-κB α (IκBα) (C21, SC-371, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology) и анти-p-NF-κB p65 Ab (27. Ser536, SC-136548, 1:500; Santa Cruz Biotechnology).Отсканированные блоты обрабатывали программой ImageJ версии 1.4.3.67 и измеряли интенсивность полос. Анализ данных проводили с использованием Microsoft Excel 2010 и GraphPad Prism 6.

Количественное определение ядерной транслокации p65 с помощью ImageStream

Клетки со сверхэкспрессией A20, нокдаун A20 и контрольные клетки THP-1 (1 × 10 7 ), инфицированные P. gingivalis или неинфицированные в качестве контроля, собирали и фиксировали в 4% параформальдегиде и хранили в течение ночи при 4°C.После промывки в пермеабилизирующем промывочном буфере (PWB), состоящем из 3% FCS и 0,02% Triton X-100 в PBS, клетки метили p65 Ab и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и снова промывали в буфере PWB. Затем клетки инкубировали с козьими антимышиными IgG Ab Alexa Fluor 488 и DAPI при комнатной температуре в темноте в течение 45 мин и трижды промывали буфером PWB. После последней промывки клетки ресуспендировали в 50 мкл PBS перед визуализацией с помощью проточного цитометра ImageStream Mark II (30).Анализы проводились с использованием программного обеспечения IDEAS (Amnis, Сиэтл, Вашингтон). В анализах использовались следующие антитела: p65 (SC-136548, 1:25; Santa Cruz Biotechnology), антимышиный IgG-Alexa Fluor 488 (A11001, 1:200; Thermo Fisher Scientific) и DAPI (46190, 1:400; Thermo Fisher Scientific).

Модель периодонтита, индуцированного лигатурой

Воспаление пародонта и потеря костной массы были вызваны наложением лигатуры в соответствии с ранее опубликованными протоколами (26). Вкратце, A20 +/+ ( n = 17) и A20 +/- мышей ( n = 16) (самцы, однопометники) были анестезированы, т.е.п. с 200 мкл смеси кетамина (10 мг/мл) и ксилазина. Черные шелковые нити 5-0 помещали на левую сторону верхней челюсти в межзубном промежутке между первым и вторым молярами верхней челюсти, а правые стороны оставляли не перевязанными в качестве контроля. Мышей подвергали эвтаназии через 7 дней после наложения лигатуры. Для определения потери альвеолярной кости использовали микрокомпьютерную томографию (микро-КТ) (SkyScan 1173; Bruker, Kontich, Бельгия) (26). Черепа, использованные для микро-КТ, хранили и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине не менее 24 часов до визуализации.Образцы сканировали с разрешением 1120 × 1120 пикселей (размер пикселя изображения 15,82 мкм) под углом 180°, напряжением 80 кВ, током 80 мкА и временем экспозиции 250 мс. Через каждые 0,2° получали пять рентгеновских проекций и усредняли их. Стандартную реконструкцию по Фельдкампу выполняли с использованием программного обеспечения NRecon (Bruker) с коррекцией лучевого упрочнения 15% и ядром сглаживания по Гауссу 1. Мышей ( n = 6) и A20 +/− ( n = 6) (самцы, однопометники) фиксировали в 4% формальдегиде, делали срезы и окрашивали H&E в соответствии со стандартным протоколом.Гистологические изображения были получены с использованием системы визуализации Q-Color 5 от Olympus Microscopy с объективом с 10-кратным увеличением. Количественное определение количества ядерных клеток (гематоксилин-позитивных) в десне проводилось исследователем вслепую с использованием программного обеспечения CellSens при 20-кратном увеличении. Подсчет проводился с использованием инструмента «Подсчет и измерение» и опции «Ручной порог», чтобы выбрать исходную ядросодержащую ячейку для сравнения. Как только исходная ячейка была выбрана, последующие ячейки автоматически выбирались до тех пор, пока не были выделены все зародышевые клетки.Данные представляли в виде окрашенной площади (квадратные микрометры) в каждом поле зрения. Анализировали девять областей/полей зрения на перевязанную сторону и шесть областей/полей зрения анализировали на контрольную сторону на мышь соответственно.

Статистический анализ

Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки или непарного теста t с поправкой Манна-Уитни с использованием программы InStat (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз в трех экземплярах, и значение p <0.05 считается значительным.

Результаты

Повышение экспрессии A20 в макрофагах человека при инфицировании

P. gingivalis датчики, в том числе TLR. TLR экспрессируются различными клетками пародонта, включая макрофаги, и реагируют на микробиоту полости рта, тем самым внося непосредственный вклад в патофизиологию пародонтита.A20 экспрессируется в соединительной ткани десны (26). Чтобы определить функцию A20 в слизистой оболочке полости рта, мы использовали модель заболевания, вызванного бактериями полости рта, и оценили экспрессию A20 в макрофагоподобных клетках человека (THP-1) после инфекции P. gingivalis . Вкратце, уровень мРНК и белка A20 определяли после инфицирования P. gingivalis с использованием qRT-PCR и вестерн-блоттинга соответственно. Клетки THP-1 демонстрировали повышенную экспрессию мРНК A20 уже через 1 час после P.gingivalis , которая достигла пика через 3 часа и сохранялась на высоком уровне до 12 часов (рис. 1А). Уровни белка A20 также были значительно повышены после бактериальной инфекции, которые достигли пика через 3 часа и оставались высокими до 12 часов (рис. 1B, 1C). Эти результаты показывают характер экспрессии A20 в макрофагах после оральной микробной инфекции.

РИСУНОК 1. Экспрессия

A20 увеличивается в макрофагах человека при заражении P. gingivalis . Клетки THP-1 инфицировали P.gingivalis (100 MOI) в течение указанного времени, и клетки собирали и подвергали количественной RT-PCR ( A ) и вестерн-блоттингу ( B ), и уровни белка наносили на график ( C ). Блоты получены из одних и тех же образцов белка. Результаты представляют как минимум три независимых эксперимента с показанными средними значениями и стандартным отклонением. На протяжении всей рукописи пятна на одной панели получены из одних и тех же образцов белка.** p ≤ 0,01, **** p ≤ 0.0001.

Потеря А20 вызывает повышенную продукцию воспалительных цитокинов в макрофагах человека после инфекции

P. gingivalis

Макрофаги считаются одним из ключевых типов клеток в среде воспаления пародонта. Активированные макрофаги продуцируют медиаторы воспаления, которые привлекают различные иммунные клетки для сдерживания инфекции. Несвоевременное купирование воспалительной реакции приводит к деструкции тканей пародонта. Чтобы определить, служит ли A20 одной из нижестоящих регуляторных молекул при воспалении слизистой оболочки ротовой полости, вызванном патогенами, в нашей следующей серии экспериментов использовались анализы потери функции, в которых система нокдауна A20 была сконструирована в клетках THP-1 с последующим бактериальная инфекция полости рта.Клетки THP-1, трансдуцированные лентивирусом, содержащим ген A20, нацеленный на sgRNA, демонстрировали сниженные уровни белка A20 по сравнению с контрольными клетками (рис. 2A). Как и ожидалось, истощение A20 вызывало значительное увеличение продукции IL-6 и TNF после инфекции P. gingivalis по сравнению с контрольными клетками (рис. 2B, 2C). Эти результаты показали, что дефицит A20 вызывает повышенную продукцию провоспалительных цитокинов в макрофагах человека после оральной микробной инфекции.

РИСУНОК 2.

Потеря A20 вызывает повышенную продукцию воспалительных цитокинов в макрофагах человека после инфекции P. gingivalis . Клетки THP-1 инфицировали лентивирусом, содержащим нацеливающий на sgRNA A20 (sgRNA-A20) или пустой вектор (пустой), и уровни белка A20 определяли с помощью вестерн-блоттинга ( A ). Клетки инфицировали P. gingivalis (100 MOI) в течение 6 часов. Уровни IL-6 ( B ) и TNF ( C ) в супернатантах определяли с помощью ELISA.Результаты являются репрезентативными как минимум для трех независимых экспериментов, проанализированных в трех повторностях, с указанием средних значений и стандартного отклонения. *** р ≤ 0,001.

Сверхэкспрессия A20 ингибирует выработку цитокинов в макрофагах человека после инфицирования

P. gingivalis Клетки THP-1 посредством трансдукции лентивирусом, экспрессирующим A20 или GFP (в качестве контроля).Вестерн-блоттинг подтвердил повышенные уровни белка А20 в клетках, трансдуцированных лентивирусом, экспрессирующим А20, по сравнению с контрольными клетками (фиг. 3А). В частности, базальные уровни A20 в генетически модифицированных клетках увеличивались в 1,5–2 раза по сравнению с контрольными клетками. Возможно, что лентивирусная трансдукция сама по себе может активировать сигнальный путь NF-κB (31). После бактериальной инфекции экспрессия A20 увеличивалась в 3 раза в клетках со сверхэкспрессией A20 и контрольных клетках и в 1,5 раза в клетках, экспрессирующих GFP, по сравнению с исходным уровнем.Хотя GFP-экспрессирующие контрольные клетки демонстрировали относительно меньшую индукцию A20 в ответ на бактерии (на 28% меньше по сравнению с контрольными клетками, инфицированными бактериями), это не было связано с какими-либо значительными фенотипическими различиями между клетками. Макрофаги с повышенной экспрессией A20 продуцировали значительно меньше IL-6 и TNF при заражении P. gingivalis по сравнению с контрольными клетками (фиг. 3B, 3C). Подтверждая результаты, полученные с помощью анализов потери функции, эти данные демонстрируют, что сверхэкспрессия A20 препятствует выработке провоспалительных цитокинов, индуцированных пероральными патогенами, в макрофагах.

РИСУНОК 3. Сверхэкспрессия

A20 ингибирует продукцию цитокинов в макрофагах человека после инфицирования P. gingivalis . Клетки THP-1 инфицировали лентивирусом, экспрессирующим A20 (A20) или GFP; Уровни белка А20 определяли с помощью вестерн-блоттинга ( А ). Клетки инфицировали P. gingivalis (100 MOI) в течение 6 часов. Уровни IL-6 ( B ) и TNF ( C ) в супернатантах определяли с помощью ELISA. Результаты являются репрезентативными как минимум для трех независимых экспериментов, проанализированных в трех повторностях, с указанием средних значений и стандартного отклонения.**** р ≤ 0,0001.

A20 регулирует воспалительную реакцию на инфекцию

P. gingivalis путем вмешательства в передачу сигналов NF-kB инфекция в макрофагах человека. Сигнальный путь NF-κB является одним из наиболее важных путей, опосредующих воспаление, а также играет важную роль в патогенезе заболеваний пародонта посредством активации генов цитокинов.Чтобы определить, оказывает ли A20 свое влияние на воспалительную реакцию, индуцированную бактериями полости рта, через сигнальный путь NF-κB, мы отслеживали деградацию IκBα, отличительного признака активации NF-κB и фосфорилирования p65, а также ядерную транслокацию в A20-компетентных и измененных клетках. клеток с помощью иммуноблотинга и ImageStream. После клеточной стимуляции внеклеточными стимулами IκBα фосфорилируется, а затем последовательно деградирует в цитоплазме. Возможное повторное накопление IκBα приводит к ингибированию NF-κB, что приводит к снижению продукции цитокинов (32–35).Следовательно, мы сначала измерили уровни белка IκBα в разное время в течение 6 часов после заражения P. gingivalis . Результаты показали быструю деградацию IκBα уже через 15 минут с последующим его восстановлением в более поздние моменты времени (рис. 4A, 4B, 5A, 5B). Этот паттерн согласовывался с установленными моделями индуцированной стимулом деградации IκBα с последующим его повторным накоплением и указывал на активацию NF-κB в ответ на P. gingivalis (32–35). Анализы уровней белка через 3 и 6 часов после инфицирования выявили повышенную деградацию IκBα и снижение реаккумуляции в A20-истощенных клетках по сравнению с A20-компетентными клетками, что указывало на повышенную активность NF-κB в A20-дефицитных клетках (рис.4А, 4В). Чтобы еще больше подтвердить наши выводы, мы также оценили ядерную транслокацию p65 с помощью технологии ImageStream, которая сочетает в себе цифровую визуализацию высокого разрешения с технологией количественной проточной цитометрии. Данные были проанализированы с помощью функции «Сходство» программного обеспечения IDEA для определения перекрытия (или сходства) окрашивания NF-κB (p65) с окрашиванием ядер (DAPI), чтобы высокая корреляция локализации NF-κB/DAPI отражалась высокая оценка сходства (30, 36–39). Кроме того, процент клеток, проявляющих ядерную транслокацию p65, также определяли на основании оценки сходства >0.5 (обозначена оранжевой линией на графиках) (фиг. 4C, 5C). Более высокий показатель сходства p65/DAPI указывает на более высокий процент перекрытия между p65 и DAPI, что предполагает повышенный уровень ядерной транслокации p65. Анализ выявил отрицательные показатели сходства на исходном уровне как для A20-истощенных, так и для A20-компетентных клеток, что соответствовало отсутствию ядерной транслокации NF-κB (p65) (рис. 4C). Подтверждая результаты, полученные с помощью иммуноблоттинга, более высокий процент транслокации p65 был отмечен в клетках с истощением по A20 по сравнению с компетентными по A20 клетками после бактериального заражения (64.7% для A20-истощенных и 21,3% для A20-компетентных через 15 минут после заражения; 80,3% для A20-истощенных и 67,1% для A20-компетентных через 30 мин после заражения) (рис. 4D, 4E). Чтобы дополнительно проверить активность NF-κB, мы также определили уровни фосфорилированного p65 и наблюдали повышенное фосфорилирование p65 в истощенных по A20 клетках по сравнению с A20-компетентными контрольными клетками через 15 и 30 минут после инфекции P. gingivalis (рис. 4F). . Следует также отметить, что в истощенных клетках наблюдалось несколько повышенное базальное содержание фосфорилированного p65, тогда как в контрольных клетках, содержащих лентивирус с пустым вектором, повышения не наблюдалось.Это увеличение, опять же, может быть результатом трансдукции лентивируса, обладающей легким стимулирующим эффектом на передачу сигналов NF-κB (31). Тем не менее, повышенное фосфорилирование p65, отмеченное только в A20-истощенных клетках, но не в A20-компетентных контрольных клетках, предполагает, что базальная экспрессия A20 ограничивает активацию сигнального пути NF-κB. Эти результаты в совокупности подтвердили повышенную активность NF-κB, связанную с дефицитом A20. Далее мы оценили, влияет ли сверхэкспрессия A20 на передачу сигналов NF-κB после оральной бактериальной инфекции.Как и ожидалось, экзогенная экспрессия A20 мешала деградации IκBα (рис. 5A, 5B) и ядерной транслокации p65 (рис. 5C-E) после инфекции P. gingivalis . Наши результаты показали более раннее восстановление IκBα через 30 минут в клетках со сверхэкспрессией A20 по сравнению с клетками WT, которые демонстрировали отсроченное повторное накопление через 3 часа (рис. 5A, 5B). Анализ транслокации p65 с использованием ImageStream также показал согласованные результаты, в которых все клетки имели отрицательные показатели сходства на исходном уровне (рис. 5C).Дальнейшие анализы выявили более низкий процент транслокации р65 в ядро ​​в клетках со сверхэкспрессией А20 по сравнению с контрольными клетками (9,43% для клеток со сверхэкспрессией А20 и 29,6% для контрольных клеток через 15 минут после заражения; 52,1% для клеток со сверхэкспрессией А20 и 75,5%). для контрольных клеток через 30 мин после заражения) (рис. 5C-E). В подтверждение результатов было отмечено снижение уровня фосфорилированного p65 в клетках со сверхэкспрессией A20 по сравнению с контрольными клетками через 15, 30 минут и 1 час после заражения P. gingivalis (фиг.5F), предполагая ингибирование А20 фосфорилирования р65. В совокупности наши результаты показывают, что A20 регулирует воспалительный цитокиновый ответ, вызванный бактериями полости рта, посредством своего влияния на сигнальный путь NF-κB.

РИСУНОК 4.

Нокдаун A20 увеличивает деградацию IκBα и способствует ядерной транслокации p65. Клетки THP-1 инфицировали лентивирусом, содержащим sgRNA-нацеливающую A20 (sgRNA) или пустой вектор (пустой), и стимулировали P. gingivalis (100 MOI) в течение указанных периодов времени.Уровни белка IκBα определяли с помощью вестерн-блоттинга ( A и B ). Клетки THP-1 стимулировали P. gingivalis (5 MOI) в течение 0, 15 или 30 мин. Клетки собирали и окрашивали с помощью p65 Ab и DAPI. Изображения были собраны в ImageStream, и графики отражают процент клеток со сходством, определенным как p65, транслоцированный и совместно локализованный с DAPI. На графиках показан процент клеток с оценкой сходства > 0,5, что представлено оранжевой линией ( C ).Репрезентативные изображения клеток с использованием ImageStream (исходное увеличение ×60) ( D ). На график нанесен процент колокализации ядра р65 (E). Результаты являются репрезентативными как минимум для трех независимых экспериментов. A20-истощенные и контрольные клетки стимулировали P. gingivalis (100 MOI) в указанные моменты времени, и клетки лизировали 1× загрузочным буфером SDS. Лизаты подвергали вестерн-блоттингу, определяя уровни белка фосфорилированного p65 ( F ).

РИСУНОК 5.

Экзогенный A20 снижает деградацию IκBα и ядерную транслокацию p65. Клетки THP-1, инфицированные лентивирусом, экспрессирующим A20 (A20) или GFP, стимулировали P. gingivalis (100 MOI) в течение указанного времени. Уровни белка IκBα определяли с помощью вестерн-блоттинга ( A и B ). Клетки THP-1 (контроль) и клетки со сверхэкспрессией A20 (A20) стимулировали P. gingivalis (5 MOI) в течение 0, 15 или 30 мин. Клетки собирали и окрашивали с помощью p65 Ab и DAPI.Изображения были собраны в ImageStream, и графики отражают процент клеток со сходством, определенным как p65, транслоцированный и совместно локализованный с DAPI. На графиках показан процент клеток с оценкой сходства > 0,5, что представлено оранжевой линией ( C ). Репрезентативные изображения клеток показаны с использованием ImageStream (исходное увеличение × 60) ( D ). На график нанесен процент колокализации ядра р65 (E). Результаты являются репрезентативными как минимум для трех независимых экспериментов.Сверхэкспрессирующие A20 и контрольные клетки стимулировали P. gingivalis (100 MOI) в указанные моменты времени. Клетки лизировали буфером для загрузки 1× SDS, и лизаты подвергали вестерн-блоттингу, определяя уровни белка фосфорилированного p65 ( F ).

Дефицит A20 увеличивает продукцию цитокинов, индуцированную оральными патогенами, и активность NF-kB в мышиных BMDM

Наша следующая серия экспериментов включала модели заболеваний пародонта ex vivo с использованием трансгенных мышей с дефицитом A20 для оценки функции A20 в мышиных клетках.BMDM, полученные от трансгенных мышей с дефицитом A20 ( A20 +/- ) и мышей A20 WT ( A20 +/+ ), подвергали заражению P. в супернатантах культур клеток определяли с помощью ELISA; деградацию IκBα в клеточных экстрактах отслеживали в разные моменты времени с помощью вестерн-блоттинга. Подобно результатам, полученным с клетками человека, A20-дефицитные ( A20 +/− ) мышиные макрофаги продуцировали значительно повышенные уровни IL-6 и TNF по сравнению с клетками, полученными от мышей A20 WT ( A20 +/+ ) (Рисунок.6А, 6В). Мы также обнаружили повышенную деградацию IκBα в BMDM, полученных от мышей A20 +/− , по сравнению с деградацией от мышей A20 +/+ через 30 мин–6 ч после заражения, что указывает на повышенную активацию NF-κB у . A20 -дефицитные клетки (фиг. 6C, 6D). В целом, доклинические исследования с использованием клеток человека и мыши подтвердили, что A20 может сдерживать воспалительную реакцию на бактерии полости рта посредством модулирования сигнального пути NF-κB.

РИСУНОК 6.Дефицит

A20 увеличивает выработку цитокинов и активность NF-kB после инфекции P. gingivalis в мышиных макрофагах костного мозга (BMDM). BMDM, выделенные от мышей A20 +/+ и A20 +/− , стимулировали P. gingivalis (100 MOI) в течение 12 часов, а супернатант собирали и применяли для ELISA для IL-6. ( A ) и TNF ( B ). BMDM, выделенные от мышей A20 +/+ и A20 +/− , были инфицированы P.gingivalis (100 MOI) в течение указанных периодов времени, а уровни белка IκBα определяли с помощью вестерн-блоттинга ( C и D ). Результаты являются репрезентативными как минимум для трех независимых проанализированных экспериментов с указанием средних значений и стандартного отклонения. *** р ≤ 0,001, **** р ≤ 0,0001.

Частичная потеря A20 вызывает усиленное воспаление десен и потерю альвеолярной кости по сравнению с мышами, компетентными в отношении A20 неделю после рождения, в то время как мышь

A20 +/- жизнеспособна, имеет нормальный размер и не проявляет грубых физиологических или поведенческих отклонений (16).Мы наблюдали повышенную активность NF-κB и продукцию цитокинов в клетках, выделенных от мыши A20 +/− после оральной бактериальной инфекции ex vivo, по сравнению с клетками мыши A20 +/+ (рис. 6). . Это наблюдение побудило нас выдвинуть гипотезу о том, что даже частичная потеря А20 может привести к явному воспалительному фенотипу в слизистой оболочке полости рта in vivo. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали модель индуцированного лигатурой пародонтита у мышей с дефицитом гаплоидов A20 ( A20 +/- ) и мышей дикого типа ( A20 +/+ ).Вкратце, шелковые швы накладывали между левыми молярами верхней челюсти, а правые зубы не лигировали в качестве исходного контроля в двух группах животных ( A20 +/+ и A20 +/- ). Потеря альвеолярной кости определялась путем измерения расстояния между цементно-эмалевым соединением и гребнем альвеолярной кости с помощью микро-КТ на 7-й день после наложения лигатуры слепым исследователем. Как и ожидалось, лигированные стороны обеих мышей A20 +/+ и A20 +/- показали значительно повышенную потерю костной массы по сравнению с нелигированными контрольными сторонами (рис.7А, 7В). Однако лигированные зубы мышей A20 +/- показали большую потерю костной массы по сравнению с лигированными зубами мышей WT. Далее мы оценили инфильтрацию иммунных клеток в рассеченных тканях десен каждой группы мышей с помощью окрашивания H&E. В соответствии с данными о потере костной массы, лигированные участки как у мышей WT ( A20 +/+ ), так и у мышей с дефицитом A20 ( A20 +/− ) демонстрировали повышенную инфильтрацию воспалительными клетками, в которых было немного больше воспалительных клеток. клеточная инфильтрация, наблюдаемая в тканях десны, полученных от мышей A20 +/- , по сравнению с аналогами WT (рис.7С, 7D). Впоследствии мы определили экспрессию цитокинов в тканях десны, чтобы дополнительно выяснить влияние потери A20 на воспалительные реакции в слизистой оболочке полости рта in vivo. Принимая во внимание, что экспрессия IL-6, TNF, IL-17 и IL-23 повышалась как в лигированных сайтах A20 +/+ , так и в A20 +/− по сравнению с нелигированными сайтами, что согласуется с ex vivo, ткани десны с частичной потерей A20 ( A20 +/- ) демонстрировали значительно повышенную экспрессию цитокинов по сравнению с их A20-компетентными аналогами (рис.7Е–Н). В целом, результаты исследований in vivo подтверждают данные ex vivo и служат доказательством концепции, обосновывающей роль А20 как ключевой регуляторной молекулы для сдерживания воспаления и поддержания тканевого гомеостаза слизистой оболочки полости рта (рис. 8).

РИСУНОК 7.

Частичная потеря A20 провоцирует повышенное воспаление десен и потерю альвеолярной кости по сравнению с A20-компетентными мышами. Шелковые нити 5-0 помещали на левую сторону верхней челюсти в межзубном промежутке между первым и вторым молярами верхней челюсти, а правые стороны не лигировали в качестве контроля на A20 +/+ и A20 +/− . мышей.Потерю костной ткани определяли с помощью микро-КТ ( A ), а также анализировали и наносили на график цементно-эмалевое соединение — гребень альвеолярной кости ( B ) ( n = 17 для A20 +/+ , n = 16 для A20 +/− ). Показаны средние значения и стандартное отклонение. Ткани десны, полученные из лигированного или контрольного периодонта, подвергали окрашиванию гематоксилин-эозином ( C ) и исследовали под микроскопом, а процент воспалительных клеток в периодонте рассчитывали и наносили на график ( D ).Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов, при этом в каждой группе анализируется минимум четыре мыши на эксперимент. Ткани десны, полученные из лигированного или контрольного периодонта, расщепляли и наносили на препарат РНК. Уровни мРНК mIL-6 ( E ), mTNF ( F ), mIL-17 ( G ) и mIL-23 ( H ) определяли с помощью qRT-PCR, а относительную экспрессию мРНК были нанесены уровни. Данные являются репрезентативными для трех проанализированных независимых экспериментов, показаны средние значения и стандартное отклонение.* р ≤ 0,05, ** р ≤ 0,01, *** р ≤ 0,001, **** р ≤ 0,0001.

РИСУНОК 8.

Репрезентативная модель оси NF-κB/A20/цитокин в поддержании гомеостаза ткани слизистой оболочки полости рта. Нарушение регуляции иммунного ответа на разнообразную группу резидентной микрофлоры полости рта вызывает стойкое воспаление, нарушение тканевого гомеостаза и, в конечном итоге, заболевание пародонта, которое характеризуется разрушением ткани десны и кости, окружающей зубы.Поддержание тканевого гомеостаза требует наличия полностью функциональных регуляторных путей для контроля как своевременного начала, так и прекращения воспаления. Инициирование воспаления слизистой оболочки полости рта в основном обусловлено активацией врожденных сенсоров и сигнального каскада NF-κB и последующим высвобождением воспалительных цитокинов. Вкратце, индуцированная микробами активация врожденных сенсоров (например, TLR и рецепторов, подобных домену олигомеризации [NLR]), вызывает рекрутирование адаптеров, таких как MyD88 и TRIF, для активации комплексов IRAK, TRAF6 и TAK1.Последующее убиквитинирование TRAF6 приводит к фосфорилированию и деградации IκBα, что приводит к ядерной транслокации NF-κB и транскрипции генов, кодирующих экспрессию провоспалительных цитокинов. Активация передачи сигналов NF-κB и начальный приток воспалительных цитокинов вызывают повышенную экспрессию A20 как часть петли отрицательной обратной связи. Впоследствии A20 способствует своевременному прекращению передачи сигналов NF-κB путем деубиквитинирования TRAF6, тем самым способствуя разрешению воспаления и поддержанию гомеостаза тканей полости рта, тогда как дефицит A20 приводит к устойчивой воспалительной реакции и сопутствующему повреждению тканей из-за длительного высвобождения цитокинов и тканеразрушающих ферментов. .(40) . В настоящее время широко признано, что методы лечения, направленные на модуляцию иммунных реакций хозяина, предлагают многообещающие возможности для тонкой настройки неконтролируемого воспаления пародонта и восстановления тканевого гомеостаза (41, 42).Исследования, проведенные за последнее десятилетие, определили взаимодействие между молекулярными паттернами, связанными с микробами полости рта, и TLR, а также установили ключевые воспалительные пути, такие как NF-kB, которые инициируют воспаление пародонта (1–3). Тем не менее, мы до сих пор мало знаем о нижестоящих сигнальных путях и молекулах, которые способствуют своевременному прекращению воспалительной реакции в слизистой оболочке полости рта. В текущем исследовании, посредством серии экспериментов с участием хорошо зарекомендовавших себя доклинических моделей заболеваний пародонта, мы предоставили несколько линий доказательств, показывающих, что A20 смягчает воспалительные реакции на резидентные бактерии полости рта, вмешиваясь в передачу сигналов NF-κB и выработку цитокинов, и действует как привратник. воспаления слизистой оболочки полости рта (рис.8). Насколько нам известно, это первое исследование, подчеркивающее участие молекулы, редактирующей убиквитин, в управлении гомеостазом тканей ротовой полости. Во-первых, истощение A20 значительно увеличивало активность NF-κB и продукцию провоспалительных цитокинов в ответ на инфекцию P. gingivalis как в клетках человека, так и в клетках мыши. Соответственно, анализы усиления функции, в которых A20 была сверхэкспрессирована с использованием лентивирусной инфекции, приводили к снижению активности NF-κB и продукции цитокинов.Последующие эксперименты с использованием мышиной модели пародонтита, индуцированной лигатурой, впервые показали, насколько нам известно, что даже частичная потеря А20 модулирует микроокружение ротовой полости и способствует усилению воспалительного фенотипа, дополнительно подтверждая участие А20 в биологических реакциях. в тканях пародонта. В конечном счете, наши результаты показывают уникальную физиологическую роль A20 как одной из ключевых регуляторных молекул передачи сигналов NF-κB в слизистой оболочке полости рта. Это открытие проливает новый свет на патогенез пародонтита и открывает новые области исследований для оценки потенциала терапии, нацеленной на A20, для облегчения неблагоприятных клинических исходов как в местных, так и в отдаленных тканях.

Новые данные свидетельствуют о том, что восприятие хозяином комменсальной микрофлоры имеет решающее значение для поддержания гомеостаза тканей, где A20 служит одним из эндогенных регуляторов, в основном функционирующих после передачи сигналов NF-κB. Подтверждая это, устранение MyD88, которая является адаптерной молекулой передачи сигналов TLR, облегчает спонтанное воспаление и смерть у мышей с дефицитом A20 ( A20 -/- ), подтверждая решающую роль A20 в интерфейсе хозяин-микробиом ( 16).До сих пор было недостаточно знаний о регуляторной роли A20 в слизистой оболочке полости рта, поскольку он связан со специфическими взаимодействиями клеток и микробиома. В этом исследовании мы заполнили этот пробел, расчленив клеточно-специфическую функцию для A20 в клетках человека и мыши, используя P. gingivalis в качестве модельного микроорганизма полости рта. Наши результаты показали, что A20 действует как негативный регулятор воспаления посредством модулирования NF-κB и, следовательно, продукции цитокинов в макрофагах при оральной микробной инфекции.Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, в которых оценивалась функция А20 в других тканях и клетках (43, 44). Например, A20 был идентифицирован как один из ключевых регуляторов кишечного гомеостаза, в котором он действует, ограничивая спонтанную активацию и размножение миелоидных клеток, одновременно защищая барьерную стабильность кишечного эпителия, предотвращая апоптоз эпителиальных клеток во время воспаления (45). Сообщалось, что в кишечнике тяжелая воспалительная реакция, связанная с дефицитом A20, была наиболее сильной в толстой кишке, где бактерий было больше.В другом исследовании было показано, что воспалительные реакции хозяина на инфекцию Mycobacterium fortuitum отрицательно регулируются посредством TLR2-зависимой экспрессии A20 в мышиных макрофагах (46). Примечательно, что сообщалось, что грубый морфотип клинического штамма вызывал повышенную провоспалительную сигнальную активацию и меньшую индукцию A20 при BMDM по сравнению с ответами, наблюдаемыми при гладком морфотипе, что предполагает различия среди разных бактерий в облегчении индукции A20.На самом деле, есть также сообщения о том, что определенные бактерии и пробиотики способствуют экспрессии A20 (47, 48). В этом исследовании мы использовали P. gingivalis , который является одним из ключевых пародонтологических патогенов, в качестве модельного микроорганизма для имитации воспаления полости рта, вызванного бактериями. Учитывая разнообразие микробиома полости рта, крайне важно определить, как определенные бактерии или группы бактерий индуцируют экспрессию A20 и поддерживают ли они устойчивость A20 в слизистой оболочке полости рта.

В этом исследовании мы использовали макрофаги для оценки функции функции A20 при воспалительных реакциях, вызванных бактериями полости рта.Следует отметить, что A20 служит ключевой регуляторной молекулой в некоторых других типах клеток. Например, сообщалось, что эпителиальные клетки дыхательных путей и кишечника демонстрируют повышенную экспрессию A20 в зависимости от времени и дозы после стимуляции LPS (22, 49–51). Сообщалось, что в модели сепсиса специфичный для дендритных клеток A20 сохраняет иммунный гомеостаз в стационарных условиях и вызывает толерантность к LPS (52). Более того, сообщалось, что А20 может быть необходим для дифференцировки и созревания иммунных клеток, а также предотвращает аутоиммунитет, ограничивая выживание В-клеток (53–55).Учитывая, что ткани пародонта включают как миелоидные, так и немиелоидные клетки, обладающие уникальными функциями в обеспечении физиологических реакций и во время инфекционного заражения, еще предстоит определить, как A20 функционирует в других клетках периодонта, помимо макрофагов.

Клинически A20 экспрессируется как в эпителии десны, так и в соединительной ткани (26). Интересно, что, несмотря на повышенные уровни мРНК, уровни белка A20 не увеличиваются при поражениях периодонтита, что позволяет предположить, что уровни белка A20 могут не поддерживаться в слизистой оболочке полости рта, вероятно, из-за посттранскрипционной регуляции (26).Фактически, пациенты с кистозным фиброзом, заболеванием, при котором наблюдается длительное опосредованное NF-κB воспаление во многих органах, также имеют сходные характеристики. Большинство смертей при муковисцидозе в основном связаны с развитием чрезмерного воспаления легких из-за микробных возмущений, таких как инфекция Pseudomonas aeruginosa . Было показано, что по сравнению с клетками альвеолярного эпителия здоровых людей клетки пациентов с муковисцидозом демонстрируют более низкую базальную экспрессию А20, что указывает на нарушение функциональности А20 с чрезмерным воспалением у этих пациентов (56).В другом клиническом исследовании образцы эндобронхиальной биопсии, полученные от пациентов с астмой, показали, что уровень А20 отрицательно коррелирует с тяжестью заболевания (57). Поэтому вполне вероятно, что нарушение уровня А20 также может привести к стойкому воспалению слизистой оболочки полости рта. Действительно, в этом исследовании с использованием мышиной модели пародонтита и мышей с гаплонедостаточностью A20 ( A20 +/− ) мы смогли показать, что даже частичная потеря A20 усиливает воспаление в тканях десны и приводит к более тяжелый фенотип заболевания пародонта, определяемый значительно большей потерей костной массы и экспрессией цитокинов ткани десны у мышей с дефицитом A20 ( A20 +/- ) по сравнению с мышами, компетентными в отношении A20 ( A20 +/+ ).Подобные наблюдения были отмечены и в других условиях. Например, гаплонедостаточность A20 связана с аутоиммунным лимфопролиферативным синдромом и ранним началом аутовоспалительного заболевания, что указывает на роль A20 в восприимчивости к заболеванию (58, 59). В другом отчете сообщалось, что у мышей с недостатком A20 в энтероцитах после лечения TNF развилось обширное системное воспаление (60). Точно так же сниженная экспрессия A20 была отмечена в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга пациентов с ревматоидным артритом, у которых было показано, что A20 регулирует баланс Th27/регуляторных Т-клеток (61).IL-17 является одним из основных цитокинов в патологическом состоянии пародонтита, а также наиболее высоко экспрессирующимся цитокином в тканях десен у мышей с частичным дефицитом A20 ( A20 +/- ), которым в этом исследовании вводили лигатуры. (62). Таким образом, вполне вероятно, что передача сигналов IL-17 может быть одним из ключевых путей, управляющих воспалительными реакциями, связанными с дефицитом A20 в слизистой оболочке полости рта, и требует дальнейшего изучения.

В совокупности результаты этого исследования служат доказательством концепции и подтверждают мнение о том, что A20 необходим для поддержания тканевого гомеостаза слизистой оболочки полости рта.Один из вопросов, на который еще предстоит ответить, заключается в том, как регулируются уровни A20 в слизистой оболочке полости рта (26). Это может быть связано со многими факторами, поскольку нарушение уровня A20 из-за генетических, эпигенетических или различных других факторов окружающей среды было связано с неустойчивым воспалением и повреждением тканей при некоторых состояниях (57). Например, полиморфизмы в гене А20 связаны с повышенной предрасположенностью к ревматоидному артриту, волчанке, системной склеродермии, болезни Крона и псориазу (63–66).Кроме того, экспрессия A20 регулируется множеством микроРНК (67–74). Интересно, что некоторые из этих микроРНК по-разному экспрессируются в поражениях периодонтита, что, возможно, может быть механизмом модуляции уровней A20 в слизистой оболочке полости рта, что требует дальнейшего изучения (75). Таким образом, необходимы будущие исследования, чтобы охарактеризовать клеточно-специфическую регуляцию A20 посредством клинических исследований и использования нокаутных мышей, специфичных для линии, для выявления восприимчивых людей и разработки более целенаправленных терапевтических средств.

Таким образом, передача сигналов NF-κB считается центральным регулятором транскрипции генов в иммунной системе, а также участвует во многих биологических процессах в среде пародонтита, который является одним из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний (76, 77). ). Хотя функция A20 довольно хорошо охарактеризована в различных других местах (например, в желудочно-кишечном тракте и альвеолярных тканях) как один из основных регуляторов сигнального пути NF-κB при разрешении воспаления, только недавно она стала привлекать внимание при патологиях. поражающие ткани слизистой оболочки полости рта (78, 79).Существуют заметные различия между слизистой оболочкой полости рта и другими тканями, такие как разнообразие микробиоты полости рта, состав клеточной сети, образующей эпителиальную и соединительную ткани десны, и костная структура, поддерживающая зубочелюстную единицу. Кроме того, в отличие от других участков тела, ткани полости рта подвергаются постоянному и прямому воздействию физических и химических раздражителей в результате регулярной повседневной деятельности, что создает уникальную среду с постоянным внешним стрессом.Таким образом, поддержание гомеостаза и целостности тканей требует тонкого баланса между реакцией хозяина, микробиомом и внешним стрессом. Поэтому важно проанализировать, как ключевые воспалительные пути регулируются на клеточном и молекулярном уровне для поддержания гомеостаза ткани слизистой оболочки полости рта и влияния на фенотип заболевания с помощью моделей, специфичных для заболевания, которые могут имитировать эту отчетливую и динамичную сеть микроокружения полости рта. В конечном итоге это приведет к разработке таргетных методов лечения с максимальной эффективностью и минимальными побочными эффектами.В этом исследовании мы систематически охарактеризовали функцию A20 в отношении взаимодействия хозяина и микробиома в полости рта и выявили A20 как новый регулятор воспаления пародонта после передачи сигналов NF-κB с использованием моделей заболеваний пародонта как in vitro, так и in vivo. Наше исследование предоставляет важные доказательства в поддержку предыдущих клинических наблюдений, в которых сообщалось о недостаточной устойчивости A20 в течение пародонтита, и служит доказательством концепции для будущих трансляционных исследований для оценки последствий контроля передачи сигналов NF-κB путем нацеливания на A20 в ротовой полости. полости и, возможно, при других состояниях полости рта, связанных с воспалением в отдаленных тканях.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Сноски

  • Эта работа была поддержана грантами Службы общественного здравоохранения США R01DE025037 и R01DE027374 (для SES) Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований/Национальных институтов здравоохранения.

  • +

  • Сокращения, используемые в этой статье:

    IκBα ингибитора +
    NF-kB α
    микро-КТ
    +
    microcomputed томография
    +
    MOI множественность инфекции
    PWB +
    пермеабилизации промывочный буфер
    qRT- ПЦР
    количественная ПЦР в реальном времени
    sgRNA
    однонаправленная РНК
    TRAF6
    TNF-рецептор-ассоциированный фактор 6
    WT
    дикий тип.
  • получил 21 сентября 2018 года.
  • принят 16 января 2019 года.
  • Copyright © 2019 Американская ассоциация иммунологов, Inc.

Stomatitis: какое воспаление на слизистой оболочке рта зависит от

Оральный стоматит или мукозит — это воспаление слизистой оболочки полости рта . Это заболевание, которое может привести к легким расстройствам или перерождению в инвалидизирующее заболевание.

Причины стоматита

Стоматит — это воспалительный процесс происхождение которого пока не выяснено, но на него безусловно влияют некоторые факторы, в частности основными причинами воспаления слизистой оболочки являются:

  • противораковая терапия;
  • дефицит питательных веществ;
  • плохая гигиена полости рта;
  • привычка курить;
  • генетическая предрасположенность.

Весьма вероятно, что у онкологических больных , подвергшихся противоопухолевой терапии, химиотерапии и лучевой терапии, развивается оральный мукозит из-за ломкости тканей ротоглотки.

Симптомы орального мукозита

Стоматит проявляется постепенной симптоматикой. Первые симптомы также могут быть легкими, например, покраснение слизистой . Тогда вы можете почувствовать жжение.

Прогрессирование патологии приводит к более болезненным последствиям для больного, бывают случаи, при которых стоматит может перейти в изнурительную болезнь, в том числе из-за затруднения приема пищи.

Обострение орального мукозита включает:

Своевременное вмешательство при воспалении позволяет избежать осложнений со здоровьем.

Кроме того, стоматит может распространяться из полости рта в верхние дыхательные пути и в желудочно-кишечный тракт.

Лечение орального мукозита

Как и в случае с другими заболеваниями полости рта , профилактика всегда является лучшим лечением. Соблюдение правильной и постоянной гигиены полости рта, чистка зубов после каждого приема пищи значительно снижает риск любой инфекции.

К этому добавляется коррекция вредных привычек, которые могут увеличить риск стоматита, в том числе:

  • бросить курить;
  • избегать злоупотребления алкогольными напитками;
  • избегайте слишком горячей или слишком острой пищи;
  • избегать обезвоживания слизистой оболочки полости рта, обильное питье.

С точки зрения лечения зубов , для уменьшения боли стоматолог может назначить полоскания растворами, содержащими противовоспалительный компонент .

В более серьезных случаях показано применение геля внутри полости рта , который может действовать как защитная пленка для слизистых оболочек и в то же время является целебным при небольших поражениях и обезболивающим при постоянной боли.

Если стоматит вызван онкологическими методами лечения, такими как лучевая терапия или химиотерапия, стоматолог может назначить системную обезболивающую терапию на основе парацетамола или противовоспалительных препаратов (НПВП). В этих случаях может потребоваться более длительная терапия, чтобы уменьшить дискомфорт и боль.

Одноклеточный атлас слизистой оболочки полости рта человека выявляет стромально-нейтрофильную ось, регулирующую тканевой иммунитет в норме и при воспалительных заболеваниях

Abstract

Слизистая оболочка полости рта остается недостаточно изученной барьерной тканью, подверженной воздействию антигенов, комменсалов и патогенов. Более того, именно в этой ткани возникает одно из наиболее распространенных микробных воспалительных заболеваний человека — пародонтит. Чтобы понять эту сложную среду на клеточном уровне, мы собираем здесь атлас одноклеточного транскриптома тканей слизистой оболочки полости рта в норме и при пародонтите.Наша работа выявляет транскрипционное разнообразие популяций стромальных и иммунных клеток, предсказывает межклеточную коммуникацию и раскрывает измененную иммунную реактивность стромальных клеток, участвующих в тканевом гомеостазе и заболеваниях слизистой оболочки десны. У здоровых мы определяем уникальные популяции CXCL1,2,8-, экспрессирующие эпителиальные клетки и фибробласты, опосредующие иммунный гомеостаз, прежде всего за счет рекрутирования нейтрофилов. При заболевании мы также наблюдаем гиперреактивность стромы, особенно фибробластов, связанную с рекрутированием популяций лейкоцитов и нейтрофилов.В конечном счете, стромально-нейтрофильная ось становится ключевым регулятором мукозального иммунитета. В соответствии с этими выводами было показано, что большинство менделевских форм пародонтита связаны с генетическими мутациями в нейтрофилах и избранных генах, экспрессируемых фибробластами. Более того, мы документируем ранее недооцененную экспрессию известных рецепторов распознавания паттернов и повреждений на популяциях стромальных клеток в условиях периодонтита, предлагая пути для запуска стромальных ответов. Этот исчерпывающий атлас предлагает важный справочный материал для более глубокого понимания гомеостаза и воспаления слизистой оболочки полости рта и раскрывает уникальные стромально-иммунные взаимодействия, участвующие в тканевом иммунитете.

Введение

Слизистая оболочка полости рта является местом первого контакта 1 . Поддерживающие жизнь вещества, такие как пища, вода и воздух, проходят через ротовую полость, неся с собой аллергены, микробы и частицы пищи, когда они попадают в желудочно-кишечный тракт или дыхательную систему. Помимо постоянного воздействия микробов, аллергенов и других антигенов, ткани полости рта должны выдерживать частые микроповреждения от жевательных сил. Несмотря на эту бурную среду или, возможно, из-за нее, оральный барьер демонстрирует минимальную инфекцию на поверхности слизистой оболочки и отсутствие явного воспаления в устойчивом состоянии.Кроме того, слизистая оболочка полости рта замечательно эффективно заживляет раны 2 , так как большинство травм заживают без инфекции или образования рубцов. Тем не менее, механизмы, с помощью которых ткани слизистой оболочки полости рта интерпретируют сигналы окружающей среды и реагируют на них, до сих пор в значительной степени недооценены, что представляет большой интерес для изучения этой удивительно открытой и эластичной ткани.

Барьер слизистой оболочки полости рта представляет собой многослойный плоскоклеточный эпителий. Однако различные области ротовой полости приобрели уникальные анатомические характеристики, адаптированные к функциям и специализации их специфической микросреды 3 .Большая часть барьера слизистой оболочки полости рта состоит из многослойного плоского эпителия с минимальной кератинизацией (эпителий выстилки), который выстилает внутреннюю часть щек (слизистую оболочку щек) (рис. 1а, правая увеличенная вставка), внутреннюю часть губ, дно слизистой оболочки рта. рот и заднюю часть глотки (мягкое небо), а также защищает важные органы, такие как слюнные железы и крупные сосуды и нервы, снабжающие черепно-лицевые структуры. Остальная часть слизистой оболочки полости рта специализирована для выполнения определенных функций.Таким образом, твердое небо, спинка языка и внешняя область десны полностью кератинизированы, чтобы выдерживать постоянные механические усилия жевания (жевательный эпителий), а язык также содержит вкусовые сосочки, опосредующие восприятие вкуса. Особенно уникальной областью орального барьера является десна, слизистая оболочка, связанная с зубом (рис. 1а, увеличенная врезка слева). Наружная часть десны образована жевательным эпителием, а внутренняя сторона (десневая щель) представлена ​​неороговевающим плоским эпителием, который постепенно истончается (до 3-4 слоев у основания).Эта особенно тонкая слизистая оболочка также постоянно подвергается воздействию сложной микробной биопленки на поверхности зубов 4 и потенциально является наиболее уязвимым местом для микробной транслокации в ротовой полости 3 .

Рисунок 1: Основные типы клеток в тканях слизистой оболочки ротовой полости здорового взрослого человека.

и . Схема биопсии тканей слизистой оболочки полости рта для этого исследования с указанием их соответствующих местоположений в полости рта (E-эпителий, LP-собственная пластинка). б .Представление UMAP основных типов клеток, идентифицированных с помощью scRNA Seq (n = 15, 59 452 клетки, слева), и гистограмма относительных пропорций клеток по типу ткани (B-щечная, G-десневая) (справа). с . Иммунофлуоресценция, изображающая основные типы клеток в здоровой ткани десны и слизистой оболочки щек. Масштабная линейка: 41 мкм. Пятна обозначены и имеют цветовую маркировку. д . Скрипичные графики выбранных маркеров для основных клеточных популяций, идентифицированных с помощью scRNA Seq и относительной экспрессии для каждого типа ткани. Ось X представляет среднее значение выражения по оси z. и . t-SNE (слева) и графики пропорций (справа), показывающие представление основных типов клеток в барьерных тканях полости рта, кожи, подвздошной кишки и легких. Демография наборов данных, использованных в этом анализе, показана в дополнительной таблице 6

Фактически, можно провести основное различие в эпителии полости рта между слизистой оболочкой щеки и десны. Действительно, сообщества комменсального микробиома особенно богаты, разнообразны и сложны на границе зубов по сравнению с микробными сообществами, обнаруженными во всех других участках полости рта 5,6 , что позволяет предположить, что слизистая оболочка десны может быть специально приспособлена для взаимодействия с микробами.Кроме того, восприимчивость к заболеваниям слизистой оболочки полости рта наиболее различна для слизистой оболочки и слизистой оболочки десен. Таким образом, язвенные поражения и инфекции чаще всего присутствуют на слизистой оболочке, в то время как буллезные дерматологические заболевания встречаются на наружной десне 7 . Наконец, десна также является местом возникновения одного из наиболее распространенных воспалительных заболеваний человека — пародонтита.

Пародонтит является широко распространенным заболеванием человека, поражающим в своих формах от средней до тяжелой примерно 8% населения в целом 8 .Считается, что при пародонтите дисбиотический микробиом на поверхности зуба вызывает чрезмерное воспаление слизистой оболочки, связанной с зубом (десны), у восприимчивых людей 9,10 . Эта нерегулируемая воспалительная реакция приводит к разрушению структур, поддерживающих зуб, включая ткани слизистой оболочки и поддерживающую кость. На сегодняшний день патогенетические механизмы, вовлеченные в пародонтит, до конца не изучены.

В данном документе мы составили атлас клеток тканей слизистой оболочки полости рта человека в норме и при заболеваниях пародонта.Наша работа влечет за собой всестороннюю характеристику клеточных популяций и их транскрипционных сигнатур в условиях клинического здоровья и воспалительных заболеваний и направлена ​​​​на выявление типов клеток и функций, связанных с обеспечением гомеостаза и восприимчивости к заболеваниям на этом важном барьере. Действительно, с помощью этого атласа мы идентифицируем уникальные популяции стромальных клеток, способствующие миграции нейтрофилов в норме и увеличивающиеся в размерах при заболеваниях. Кроме того, оценка клеточной экспрессии генов, связанных с предрасположенностью к заболеваниям пародонта, дополнительно выявляет участие стромальных и иммунных клеток (особенно нейтрофилов) в предрасположенности к заболеванию.В совокупности наша работа обеспечивает клеточную перепись различных тканей слизистой оболочки полости рта в норме и при патологии и предполагает уникальную стромально-иммунную реактивность, опосредующую гомеостаз слизистой оболочки, который нарушается при воспалительном заболевании слизистой оболочки.

Результаты

Секвенирование примерно 60 000 отдельных клеток выявило 4 основных тканевых компартмента здоровой слизистой оболочки полости рта

Добровольцы прошли тщательный скрининг на системное и стоматологическое здоровье (рис.1а, дополнительная таблица 1). Биоптаты были немедленно переработаны в одноклеточную суспензию путем мягкого ферментативного расщепления и механического разделения с последующей подготовкой библиотеки и секвенированием с использованием платформы 10x Genomics Chromium Droplet. После контроля качества для удаления клеток низкого качества и клеток, экспрессирующих высокие сигнатуры митохондриальных генов, наш набор данных включал 39 801 клетку из слизистой оболочки десен (n = 10) и 17 942 клетки из слизистой оболочки щек (n = 5) (дополнительный рис. 1a-c). ). Наш анализ выявил 4 основных клеточных компартмента в слизистой оболочке полости рта, состоящих из эпителиальных, эндотелиальных, фибробластных и иммунных клеток, которые присутствовали как в слизистой оболочке десен, так и в слизистой оболочке щек здоровых взрослых (рис.1б). Гистологическая визуализация подтвердила наличие вышеупомянутых 4 основных клеточных компартментов в тканях слизистой оболочки полости рта и дала представление о тканевой архитектуре тканей слизистой оболочки полости рта (рис. 1с).

Анализ транскриптомных сигнатур для основных типов клеток задокументировал дифференциальную экспрессию генов, определяющих клетки, для 4 основных клеточных компартментов, которые, как правило, сохранялись на участках слизистой оболочки. На самом деле эндотелиальные ( ACKR1, RAMP2, SELE, VWF, PECAM1 ), фибробласты ( LUM, COL3A1, DCN, COL1A1, CFD ), иммунные ( CD69, CD52, CXCR4, PTPRC, HCST ) и эпителиальные ( KRT14, KRT5, S100A2, CTSA, SPRR1B ) гены клеток соответствовали классическим, хорошо установленным маркерам для каждой клеточной популяции (рис.1d, дополнительный рис. 1d).

Наконец, анализ опубликованных наборов данных о здоровых барьерных тканях человеческого тела (оральная полость, кожа 11 , подвздошная кишка 12 , легкие 13 ) показал, что эти 4 основные популяции также являются основными клеточными компартментами во всем организме человека. оценивали барьерные ткани (рис. 1e). Однако относительное представительство каждой основной клеточной популяции различалось между типами тканей. Представление этих 4 основных строительных блоков барьерных тканей было наиболее сопоставимо между слизистой оболочкой полости рта и кожными барьерами, хотя слизистая оболочка полости рта содержала расширенный иммунный компартмент, в то время как кожа содержала значительно больший эпителиальный компартмент (рис.1д).

Разнообразные стромальные и эпителиальные субпопуляции с различными иммунными функциями присутствуют в тканях слизистой оболочки полости рта

Субкластеризация внутри 4 основных типов клеток демонстрирует большое разнообразие популяций стромальных, эпителиальных и иммунных клеток в тканях слизистой оболочки полости рта человека, всего 34 транскрипционно различные кластеры (дополнительная рис. 2a).

В компартменте эндотелиальных клеток мы определили 4 субпопуляции венулярных эндотелиальных клеток, связанных со здоровьем (H) (H.VEC), популяция гладкомышечных клеток сосудов (H.SMC) и популяция лимфатических эндотелиальных клеток (H.LEC), все из которых были представлены как в слизистой оболочке щеки, так и в слизистой оболочке десен (рис. 2а, дополнительная таблица 2). Кластеры H.SMC и H.LEC экспрессируют гены, связанные с сокращением мышц (например, MYL9, ACTA2 ) и обязательством судьбы LEC ( PROX1 ) (рис. 2b, дополнительная рис. 2b). Субпопуляции венулярных эндотелиальных клеток экспрессируют гены, соответствующие различным функциям. Х.ВЭК 1.1, 1.3 и 1.4 были связаны с иммунными функциями. H.VEC 1.1 экспрессировал генную сигнатуру, соответствующую презентации антигена ( HLADRA, CD74 ), в то время как 1.3 и 1.4, по-видимому, стимулировали иммунные и воспалительные реакции (такие как ответ на передачу сигналов LPS и IFN) и экспрессировали гены, имеющие отношение к рекрутированию нейтрофилов и IFN. сигнализация ( CSF3, CXCL2, MX1) (рис. 2b, дополнительная рис. 2b). Клетки H.VEC 1.2 продемонстрировали сигнатуру гена, соответствующую активным путям развития эндотелия (например, NOTCh5, SOX18 ) (фиг.2б, дополнительный рис. 2б).

Рисунок 2: Стромальные и эпителиальные субпопуляции в здоровой слизистой оболочке полости рта.

а , с , е . Графики UMAP (слева) и доли (справа) эндотелиальных (22 567 клеток), эпителиальных (4 222 клеток) и фибробластных (13 839 клеток) популяций, соответственно, присутствующих в десневой (G) и слизистой оболочке щеки (B). См. методы используемых статистических тестов. *р < 0,05. б , д , ф . Точечные графики, изображающие экспрессию генов, определяющих кластер, и процент клеток, экспрессирующих каждый ген, для эндотелиальных, эпителиальных и фибробластных популяций соответственно.Значения экспрессии представляют собой средние Z-баллы. Слева от каждого точечного графика находится рисунок, иллюстрирующий подтипы, которые экспрессируют гены, связанные с иммунной активацией и рекрутированием. Графики пропорций справа от каждой иллюстрации показывают вклад каждого типа ткани в каждый подтип клеток.

В эпителиальном компартменте мы идентифицировали 4 подтипа эпителиальных клеток в здоровой слизистой оболочке полости рта; три подтипа кератиноцитов (H.Epi 1.1,1.2,1.3) и популяция меланоцитов (H.Mel) (рис.2c, d, дополнительная таблица 2). H.Mel был самым дистальным эпителиальным кластером по данным UMAP (рис. 2c) и четко представлял меланоциты на основе значительной экспрессии генов пигментации ( PMEL, MLANA ) (рис. 2d, дополнительная рис. 2c). На основании экспрессии генов клетки H.Epi 1.1 были далее классифицированы как базальные/дифференцирующиеся кератиноциты с экспрессией KRT5, KRT14 и KRT15 , в то время как клетки H.Epi 1.3 экспрессировали гены, участвующие в кератинизации и ороговении ( SPRR3, CRNN, CNFN ), обычно встречающийся в самых наружных слоях эпителия (рис.2d, дополнительный рис. 2c). В то время как H.Epi 1.1 и 1.3 присутствовали как в слизистой оболочке щеки, так и в слизистой оболочке десен, H.Epi 1.2 был обнаружен только в деснах и характеризовался профилем экспрессии генов, соответствующим воспалительным реакциям. Фактически, гены с максимальной экспрессией включали антимикробные и воспалительные факторы, такие как IL1b, SLPI и S100A8/9 , а основным путем было рекрутирование лейкоцитов, которое отражало в первую очередь рекрутирование нейтрофилов, о чем свидетельствует экспрессия CXCL1, CXCL6. , CXCL8 (фиг.2d, дополнительный рис. 2c).

Фибробласты, разделенные на 7 кластеров клеток, которые демонстрировали сигнатуры генов, соответствующие различным предполагаемым функциям (рис. 2e, дополнительная таблица 2). Кластеры фибробластов H.Fib 1.2, 1.3 и 1.4 демонстрировали сигнатуру гена, соответствующую прототипическим функциям клеточного типа, то есть организации внеклеточного матрикса, скелетному морфогенезу и ремоделированию тканей, в то время как кластеры H.Fib 1.1, 1.5 и 1.6 экспрессировали сигнатуры генов, соответствующие воспалительным реакциям, такие как активация комплемента ( C3, CFD ), ответ на LPS ( CXCL1, 2, 8 ) и связанные с развитием сигнальные пути BMP ( WNT5A ) (фиг.2f, дополнительный рис. 2d). H.Fib 1.7 был охарактеризован как миофибробластоподобная популяция на основании экспрессии родственных генов ( TAGLN, ACTA1) и присутствовал преимущественно в здоровой слизистой оболочке щек. Интересно, что «иммуноподобные» кластеры фибробластов H.Fib 1.5 (транскриптом, соответствующий врожденным иммунным ответам и рекрутированию нейтрофилов) и H.Fib 1.4 (ремоделирование тканей, MMP2, TIMP3 ) были увеличены в десне по сравнению со слизистой оболочкой щеки. (рис. 2е).

В целом, наши данные показывают сложный ландшафт эпителиальных и стромальных клеток, присутствующих в тканях слизистой оболочки полости рта, которые имеют различные предполагаемые функции.Важно отметить, что экспансия эпителиальных и стромальных клеток с признаками воспаления в десне предполагает, что врожденные иммунные ответы, особенно связанные с рекрутированием нейтрофилов и оборотом активной ткани, потенциально опосредованы стромальным компартментом слизистой оболочки десны

Т- и миелоидные клетки доминирует в здоровой слизистой оболочке полости рта

В компартменте иммунных клеток здоровой слизистой оболочки полости рта мы обнаружили богатую и разнообразную популяцию иммунных клеток. Как правило, иммунные клетки делились на 5 основных кластеров T/NK, B/плазмы и гранулоцитов/миелоидных клеток, которые соответственно определялись экспрессией классического клеточно-специфического маркерного гена (рис.3а, дополнительная таблица 3). Иммунные клетки были аннотированы с использованием SingleR и ручной аннотации, которая идентифицировала 14 уникальных типов клеток, которые были подтверждены на основе экспрессии генов для маркерных генов (рис. 3a-d). Как в слизистой оболочке щеки, так и в десне большинство иммунных клеток представляли собой Т-клетки, которые подразделялись на αβ CD4 + , T H 17, ассоциированный со слизистой оболочкой инвариант T (MAIT), αβ CD8 + , γδ T, T reg и NK/T-клетки. Второй по величине общей популяцией были миелоидные клетки, которые включали миелоидные дендритные клетки (мДК), макрофаги и нейтрофилы.Мы также наблюдали популяцию тучных клеток и небольшие популяции плазмоцитоидных DC (pDC), B и плазматических клеток (рис. 3a-d). Слизистая оболочка щеки содержала повышенную долю MAIT и CD8 + Т-клеток, тогда как пропорции T reg , тучных и В-клеток были повышены в десне. В соответствии с данными секвенирования, проточная цитометрия биоптатов независимой группы добровольцев (n = 10-14, дополнительная таблица 4) выявила общий обогащенный иммунный компартмент в десне со значительно увеличенной долей и количеством клеток CD45 + в десне. биопсии (рис. 3e).Проточная цитометрия также подтвердила наличие основных популяций иммунных клеток в здоровой слизистой оболочке полости рта, включая CD45 + CD3 + Т-клеток, CD45 + CD19 + В-клеток, CD45 + HLADR + антигенпрезентирующих клеток ( APC), HLADR CD15 + SSC high и HLADR CD117 + SSC high гранулоцитов (рис. 3f-h, дополнительная рис. 3a). Увеличение числа воспалительных клеток в слизистой оболочке десен было в первую очередь связано с повышенным присутствием гранулоцитов (тучных клеток и нейтрофилов) и В-клеток в десне по сравнению со слизистой оболочкой щеки, что согласуется с результатами секвенирования.

Рисунок 3: Иммунные популяции в здоровой слизистой оболочке полости рта.

и . UMAP (слева) и пропорциональные графики (справа) популяций иммунных клеток в слизистой оболочке полости рта (15 724 клетки; десна (G), щечная область (B)). Иммунные клетки были аннотированы с использованием комбинации эталонной (SingleR) и ручной аннотации. См. методы используемых статистических тестов. *р<0,05, **р<0,01. б-д . Точечные графики, изображающие экспрессию маркерных генов клеточного типа. е-ч . Репрезентативные графики рассеяния проточной цитометрии из буккальной (n = 3-8) и десневой (n = 8) биопсий.Клетки были отобраны из Single/Live и окрашены CD45 (e) и CD45/HLADR (f) , клетки CD45 + были дополнительно окрашены CD19/CD3 (g) и HLADR SSC . высокая CD15/CD117 (h) . Гистограммы (e-h) демонстрируют выражение в % для каждого указанного маркера. См. методы используемых статистических тестов. значения р, указанные на каждом графике.

Наконец, мы опросили популяции иммунных клеток в опубликованных базах данных здоровых барьерных тканей человеческого тела (ротовой полости, подвздошной кишки, кожи, легких).Мы обнаружили представительство подмножеств иммунных клеток, присутствующих в слизистой оболочке полости рта, через другие барьеры, но в разных пропорциях. Интересно, что мы зафиксировали значительно более высокую долю нейтрофилов на слизистой оболочке полости рта по сравнению с другими барьерами, предполагая активную врожденную иммунную реакцию на этом постоянно стимулируемом барьере и согласующуюся с уникальным фенотипом стромальных клеток, рекрутирующих нейтрофилы, на оральном барьере (дополнительная рис. 3б).

В целом эти данные иллюстрируют сложную клеточную составляющую слизистой оболочки полости рта в стабильном состоянии и показывают уникальные и расширенные клеточные популяции в слизистой оболочке десен, специализирующиеся на рекрутировании нейтрофилов и активном обмене тканей.Более того, специфичные для клеточного типа транскриптомы отражают уникальные анатомические характеристики этого участка слизистой оболочки, который подвергается микробной стимуляции и постоянному механическому срабатыванию.

Инфильтрация слизистых оболочек иммунными клетками является отличительной чертой пародонтита

Реакции организма-хозяина на десна становятся преувеличенными и деструктивными в условиях обычного воспалительного заболевания человека, пародонтита. Поэтому мы затем стремились охарактеризовать клеточные популяции и их транскриптомы на уровне отдельных клеток при пародонтите.В этих исследованиях биопсии слизистой оболочки десен здоровых взрослых сравнивали с биопсиями пациентов с нелеченным тяжелым пародонтитом с помощью секРНК и дополнительных исследований гистологии и проточной цитометрии (рис. 4а). Мы документируем глубокую инфильтрацию воспалительных клеток в тканях слизистой оболочки пародонтита с помощью этих независимых подходов. H&E и иммунофлуоресцентное окрашивание в здоровых и пораженных тканях выявили глубокую инфильтрацию тканей слизистой лейкоцитами CD45 + на фоне заболевания (рис.4б, в). Значительно увеличенное представительство воспалительных клеток также было подтверждено проточной цитометрией в независимой группе здоровых и больных людей (n = 6/группа) (рис. 4d). Наконец, интеграция здоровья с больными наборами данных scRNA seq (n = 15, ~ 54 000 клеток) выявила 31 транскрипционно отличный кластер и значительное увеличение количества иммунных клеток в очагах заболевания с соответствующим снижением количества стромальных клеток, что отражает разрушение ткани слизистой оболочки при пародонтите. Рис. 4e, дополнительный рис.4а).

Рисунок 4: Заболевание пародонта представляет собой воспалительное заболевание десен слизистой оболочки полости рта

a . Иллюстрация слизистой оболочки десен в норме (H, вверху) и при заболеваниях пародонта (P, внизу). i) прилипающая к зубу биопленка, ii) ткани слизистой оболочки, iii) кость. Присутствует схема методов анализа тканей (справа). б . Окрашивание гематоксилин-эозином репрезентативных срезов здоровых десен (слева) и периодонтита (справа). Е-эпителий, S-строма. Масштабная линейка: 100 мкм. с .Иммунофлюоресцентное окрашивание на CD45 + лимфоцитов. Масштабная линейка: 50 мкм. д . Репрезентативные графики рассеяния проточной цитометрии (слева). Клетки были отобраны из Single/Live и окрашены CD45, график показывает % экспрессии CD45 (одна точка на пациента, n=6/группа. См. методы для используемых статистических тестов, указано значение p). и . Представление UMAP основных клеточных популяций в норме и при заболеваниях пародонта (слева; H: 38 757 клеток, n = 10; P: 14 963 клетки, n = 5). График демонстрирует % изменения пропорций клеток при заболевании (справа).См. методы используемых статистических тестов. *р<0,05, **р<0,01.

Исследование типов иммунных клеток в норме и при заболевании продемонстрировало наличие тех же подмножеств иммунных клеток, которые ранее наблюдались в норме, хотя и с различными пропорциями при заболевании. Как и в случае со здоровьем, Т-клетки оставались основной популяцией иммунных клеток с представлением αβ CD4 + , T H 17, MAIT, αβ CD8 + , γδ T, T reg и NK/T-клеток при заболевании. (рис. 5а).Следующими по величине популяциями были В- и плазматические клетки, которые были значительно увеличены при пародонтите по сравнению со здоровыми (рис. 5а, б). Наконец, при заболевании также присутствовали популяции миелоидных/гранулоцитарных клеток с экспансией нейтрофилов (р=0,1429) (рис. 5а, б). Сосредоточив внимание на типах клеток, которые размножаются при заболевании, мы далее определяем сигнатуры генов для плазматических клеток и нейтрофилов при пародонтите. Большинство плазматических клеток экспрессировали IgG и легкие цепи κ или λ, в то время как небольшая, но отчетливая популяция экспрессировала IgA (рис.5в). Нейтрофилы не подразделялись на дополнительные популяции на основе наиболее экспрессируемых генов, но, по-видимому, единообразно экспрессировали классические маркеры нейтрофилов, такие как CSF3R, CXCR2 и FCGR3B (рис. 5d).

Рисунок 5: Субпопуляции иммунных клеток при заболеваниях пародонта.

и . UMAP (слева) показывает субпопуляции иммунных клеток, пространственно разделенные на три основные категории (T/NK, B/плазма и миелоидные/гранулоциты). Пропорциональный участок (средний). Цвета обозначают тип клеток, аннотированный с помощью SingleR и ручного аннотирования и подтвержденный экспрессией генов, специфичных для типа клеток (справа). б . На гистограмме показана пропорция B, плазматических клеток и нейтрофилов в норме (H) и пародонтите (P). См. методы используемых статистических тестов. ***р<0,001. c-d . Z-оценка средней экспрессии специфических маркеров плазматических клеток- (в) и нейтрофилов- (г) , визуализируемых в низкоразмерном пространстве с помощью схемы. Каждая область, содержащая клетки на UMAP, была разделена на шестиугольные области, и ячейки в каждой области были усреднены. е-ч . Репрезентативные графики рассеяния проточной цитометрии из независимой когорты здоровья и пародонтита.Клетки отделяли от одиночных/живых клеток и окрашивали CD45/CD3 (e) , CD45/CD38 (f) , CD45/CD38 (g) , CD45/CD15 (h) . Гистограммы демонстрируют % экспрессии (одна точка на человека, n=3-9/группа). См. методы используемых статистических тестов. Значения P указаны на каждом графике.

Проточная цитометрия в независимой когорте пациентов (n=3-9 человек/группа) продемонстрировала значительное увеличение числа CD3 + Т-клеток, CD38 + плазматических клеток, HLADR + APC и HLADR SSC высокая CD15 + нейтрофилы при пародонтите (рис.5д-з). Однако только плазматические клетки и нейтрофилы увеличивались пропорционально заболеванию, что согласуется с данными секвенирования отдельных клеток. Представляет интерес, хотя последовательность scRNA выявила увеличение числа нейтрофилов при пародонтите, она не отражала величину инфильтрации нейтрофилов, наблюдаемую по течению и гистологии (рис. 5h, дополнительная рис. 4b, c), что отражает относительную ограниченность этого метода в захвате транскриптомы нейтрофилов 14 .

Стромальные и эпителиальные клетки обнаруживают транскрипционные признаки воспаления при пародонтите

Затем мы исследовали изменения в стромальных и эпителиальных компартментах при заболевании.В целом как гистологический анализ, так и анализ последовательностей scRNA показали, что доли эпителиальных и стромальных клеток уменьшались при заболевании (рис. 4b, e). Исследование подмножеств клеток в комбинированной базе данных здоровья и пародонтита десен выявило новую кластеризацию стромальных/эпителиальных компартментов (теперь обозначенную буквой P на рис. 6) со сдвигами в выбранных подмножествах клеток при заболевании. Пародонтит приводил к достоверному снижению P.VEC 1,1 (p=0,0244), популяции эндотелиальных клеток, экспрессирующих антигенпрезентирующие молекулы, и увеличению P.VEC 1,2 (p = 0,0280), эндотелиальные клетки, характеризующиеся экспрессией трансэндотелиального транспортного гена PLVAP (рис. 6а, дополнительная рис. 5а). Заметные изменения, связанные с заболеванием, включали увеличение P.Epi 1.1, эпителиальных клеток, подобных базальному слою / регенерирующих, и увеличение P.Fib 1.1, подмножества фибробластов с экспрессией воспалительных хемокинов, таких как CXCL2 и CXCL13 ( Рис. 6b, c, дополнительный рис. 5b, c). В целом профиль экспрессии генов эпителиальных и стромальных клеток сместился в сторону воспалительного состояния при заболевании.В частности, эндотелиальные клетки активировали пути, связанные с клеточной адгезией и адгезией лимфоцитов (рис. 6d). Эпителиальные клетки и фибробласты активировали пути, связанные с антимикробным ответом (ответ на LPS и ответ на молекулу бактериального происхождения) и биосинтезом цитокинов соответственно (рис. 6e,f). Интересно, что гены, связанные с антимикробными процессами, активируются как в фибробластах, так и в эпителиальных клетках при заболевании, отражая активное привлечение нейтрофилов ( CXCL1, CXCL2, CXCL8 ) (дополнительная рис.5c, дополнительная таблица 5). Эти данные предполагают уникальное соединение эпителиального и стромального компартментов при пародонтите, особенно направленное на рекрутирование нейтрофилов.

Рисунок 6: Популяции стромальных клеток и стромально-иммунный интерактом при пародонтите.

а , б , в . Представление UMAP (слева) и графики пропорций (справа) для субпопуляций эндотелия (20 338 клеток), эпителия (3 653 клетки) и фибробластов (12 452 клетки) соответственно в комбинированном наборе данных о здоровье (H) и пародонтите (P).Метки генов указывают гены, определяющие кластер. См. методы используемых статистических тестов. *р < 0,05. д , д , ф . Точечные диаграммы путей, обогащенных пародонтозом, на основную клеточную популяцию. Термины GO усечены для краткости, исходные термины и список генов можно найти в дополнительной таблице 5. g . Аллювиальный график, показывающий, что выбранные пары лиганд-рецептор значительно преобладают при заболеваниях пародонта, определенных NicheNetR. Для этого анализа учитываются только взаимодействия иммунных клеток (рецепторов) со всеми другими типами клеток. ч . Взаимодействие хемокинов/хемокиновых рецепторов в норме и при заболеваниях пародонта. Точечный график, показывающий экспрессию хемокинов в основных типах клеток (вверху) и иммунных клетках в наборе данных scRNA Seq, которые экспрессируют родственные рецепторы (внизу). Обратитесь к дополнительной рис. 7 для данных экспрессии рецепторов хемокинов.

Взаимодействия стромально-иммунных клеток являются потенциальными факторами воспаления пародонта .Мы определили наиболее предсказуемые взаимодействия иммунного рецептора и лиганда на основе экспрессии генов в нашем наборе данных последовательностей scRNA, которые по-разному регулируются при заболевании. При пародонтите была обширная предполагаемая связь между стромальными и иммунными клетками (дополнительная рис. 6). Представляет интерес и согласуется с путями, активируемыми при заболевании, эндотелиальные клетки, по-видимому, способствуют адгезии иммунных клеток, в то время как фибробласты проявляют потенциал для рекрутирования воспалительных клеток (рис. 6g).В целом, основываясь на сигнатурах экспрессии генов и предсказанных взаимодействиях, наши данные указывают на активную роль стромальных клеток в привлечении иммунных клеток к месту заболевания.

Чтобы дополнительно изучить общий потенциал стромальных клеток для рекрутирования иммунных клеток, мы специально исследовали экспрессию пар хемокинов и хемокиновых рецепторов в нашем наборе данных (рис. 6h, дополнительная рис. 7). Наши данные показали широкую экспрессию хемокиновых лигандов всеми типами клеток при заболевании. В соответствии с анализом путей (рис.6f), фибробласты были особенно транскрипционно активны в продукции хемокинов. Фибробласты экспрессировали широкий спектр хемокиновых лигандов, обладающих исключительной способностью рекрутировать нейтрофилы ( CXCL1, 2, 5, 8 ), а также хемокины с потенциалом рекрутирования нескольких типов лейкоцитов ( e , g. CXCL12, CXCL13). , CCL19 ) (рис. 6з). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что стромальные клетки используют межклеточную передачу сигналов для управления рекрутированием иммунных клеток и трансмиграцией тканей при пародонтите.

Одноклеточная экспрессия генов, связанных с пародонтитом, указывает на роль как иммунного, так и стромального компартмента в восприимчивости к заболеванию

Чтобы понять вклад клеток в патогенез заболевания, мы затем исследовали клеточную экспрессию генов, связанных с предрасположенностью к пародонтиту. Отдельные менделевские генетические заболевания четко связаны с предрасположенностью к заболеваниям пародонта 15-17 , а недавние исследования GWAS выявили однонуклеотидные полиморфизмы, связанные с заболеваниями пародонта 18,19 .Однако паттерны клеточной экспрессии и роль соответствующих генетических детерминант при пародонтите остаются неясными. Наш атлас последовательностей scRNA уникально позволил нам глобально оценить экспрессию 15 существующих генов заболеваний пародонта в слизистой оболочке десен. Гены менделевской болезни, связанные с пародонтитом, почти исключительно экспрессировались в компартменте иммунных клеток, за исключением C1S и C1R (экспрессированных исключительно в фибробластах), что указывает на то, что дисфункция иммунных и потенциально фибробластных клеток является критическим фактором моногенного пародонтита.Дефекты, связанные с нейтрофилами ( HAX1, LYST, ITGB2, FPR1 ), особенно связаны с предрасположенностью к пародонтиту при генетических синдромах. Напротив, гены, ассоциированные с заболеванием, идентифицированные с помощью GWAS 20-26 , экспрессировались более широко, в том числе стромальными, эпителиальными и иммунными клетками, что позволяет предположить участие множественных путей в распространенных формах заболеваний пародонта (рис. 7а). Наше исследование связанных с заболеванием генов на тканевом уровне выявляет потенциально разнообразные клеточные популяции, вовлеченные в распространенные формы заболевания, с уникальной ролью популяций нейтрофилов и фибробластов в патогенезе менделевских форм пародонтита.

Рисунок 7: Гены, связанные с восприимчивостью к заболеваниям пародонта, микробами и чувствительностью к повреждениям слизистой оболочки полости рта.

и . Точечный график, изображающий среднюю экспрессию генов по шкале Z и процент клеток, экспрессирующих гены, связанные с медельскими формами пародонтита (слева), и гены, идентифицированные GWAS как связанные с пародонтитом (справа). б . Резюме избранных рецепторов распознавания паттернов и связанных с повреждением молекулярных паттернов и экспрессии связанных рецепторов в здоровой слизистой оболочке щеки и десен (вверху) и экспрессии в здоровых деснах и пародонтите (внизу).Экспрессия показана по основному типу ткани (эндотелиальная, фибробластная, эпителиальная, иммунная). Сплошная белая граница указывает на статистическую значимость и на ткань с более высокой экспрессией. Пунктирная граница указывает на незначительность и на ткань, экспрессия которой имеет тенденцию к увеличению. Значимость определяется непараметрическим критерием суммы рангов Уилкоксона (дополнительные таблицы 7, 8).

Микробиом и чувствительность к повреждению могут лежать в основе гиперреактивности стромы при пародонтите

Наконец, чтобы исследовать запуск взаимодействия стромально-иммунных клеток, связанных с пародонтитом, мы используем атлас для исследования экспрессии микробных и клеточных рецепторов и сенсоров в нашей базе данных клеток полости рта в здоровье и болезнь.Таким образом, мы исследуем клеточное распределение рецепторов распознавания образов, включая Toll-подобные рецепторы (TLR), рецепторы лектина С-типа (CLR), рецепторы, подобные домену олигомеризации, связывающему нуклеотиды (NLR), RIG-I-подобные рецепторы (RLR). , факторы проникновения вируса и молекулярные паттерны, связанные с повреждением (DAMP), и связанные с ними рецепторы (DAMP-R) (рис. 7b, дополнительная рис. 8). Мы документируем разнообразную экспрессию микробных и повреждающих рецепторов в эпителиальных, эндотелиальных, фибробластных и иммунных клетках в тканях полости рта в здоровом состоянии, что согласуется с микробным и/или повреждающим запуском иммунного ответа в стромальных и иммунных компартментах.Кроме того, мы обнаруживаем значительно повышенную экспрессию молекул NLR, CLR, TLR, DAMP и DAMP-R при заболевании, особенно в стромальных и эпителиальных клетках, что предполагает повышенное срабатывание этих клеточных популяций в условиях заболевания.

В совокупности наши данные подтверждают концепцию о том, что популяции стромальных клеток в слизистой оболочке десен постоянно активируются посредством обнаружения микробов и повреждений и приобретают иммунную спецификацию, направленную на рекрутирование нейтрофилов в слизистой оболочке полости рта.Более того, преувеличенная активация стромальных клеток при заболевании связана с чрезмерным набором популяций иммунных клеток и деструктивными воспалительными иммунными реакциями.

Обсуждение

В данном документе мы представляем надежный атлас тканей слизистой оболочки полости рта человека в норме и в условиях распространенного воспалительного заболевания полости рта пародонтита. Наша работа подробно описывает сложный ландшафт типов клеток слизистой оболочки полости рта и дает всестороннее представление о функциональности клеток и восприимчивости к заболеваниям на этом уникальном барьере.

Одной из сильных сторон нашего исследования является тщательная характеристика когорт пациентов со строгим определением здоровья полости рта и заболеваний пародонта. Действительно, наша группа здоровых добровольцев была проверена на предмет истории болезни, приема лекарств, употребления табака/алкоголя/наркотиков, а также была оценена с помощью анализа крови и подробного осмотра полости рта. Этот надежный дизайн исследования позволил создать атлас истинного системного и местного (орального) здоровья, который может служить общественным ресурсом для понимания типов клеток и их функций, связанных с гомеостазом тканей слизистой оболочки полости рта.Наша когорта здоровья также служит нормативной базой, относительно которой мы можем начать исследовать изменения в клеточных популяциях и их транскриптомах в условиях заболеваний тканей полости рта. Кроме того, наша оценка слизистой оболочки полости рта, связанной как с зубами (десна), так и с слизистой оболочкой (буккально), обеспечивает основу для оценки заболеваний, связанных с этими двумя отдельными участками, которые обычно проявляются с уникальной восприимчивостью к заболеваниям 27,28 .

В текущем исследовании мы изучали сдвиги в клеточных популяциях и их транскриптомах в условиях нелеченного тяжелого воспалительного заболевания пародонтита, заболевания слизистой оболочки десен.Пародонтит является одним из наиболее распространенных заболеваний человека 8 , связанным с заболеваемостью и значительными глобальными медицинскими и экономическими затратами 29 , и считается независимым фактором риска множественных системных воспалительных заболеваний 30 . Однако механизмы, лежащие в основе предрасположенности к заболеванию и патогенеза, до конца не изучены, и в настоящее время не существует целевого лечения. Наша работа здесь описывает атлас клеточных популяций, транскриптомов и взаимодействий при этом заболевании слизистой оболочки и дает представление о роли конкретных клеточных популяций в восприимчивости и патогенезе заболевания, открывая возможности для дальнейшего механистического исследования этого сложного заболевания.

Наши результаты показывают, что слизистая оболочка десны является особенно активным участком ткани с уникальной иммунологической связью и повышенной воспалительной реакцией, где популяции стромальных клеток активно способствуют гомеостатическому воспалению. Таким образом, мы не только документируем повышенное представительство иммунных клеток на этом участке слизистой оболочки полости рта (особенно гранулоцитов/нейтрофилов), но также повышенную экспрессию провоспалительных и антимикробных генов стромальными и эпителиальными клетками. Активация повышенной защиты согласуется с уникальной средой слизистой оболочки десен, которая подвергается сильному воздействию богатого и разнообразного комменсального микробиома 31 и подвергается постоянной механической стимуляции посредством жевания 32 .

Атлас показывает ранее недооцененное разнообразие стромальных и эпителиальных клеток на барьере слизистой оболочки полости рта. Мы находим, что некоторые стромальные/эпителиальные популяции поддерживают функции прототипных клеток, включая кератинизацию в эпителии, накопление и оборот матрикса в фибробластах и ​​ангиогенез/трансмиграцию клеток в эндотелиальных клетках. Кроме того, мы документируем уникальные популяции стромальных клеток с иммунной функциональностью, которые особенно распространены в слизистой оболочке десен.В норме мы характеризуем популяцию эпителиальных клеток, специфичных для десны, а также расширенные популяции фибробластов, экспрессирующих медиаторы воспаления. Экспрессия генов предполагает, что эти провоспалительные популяции в первую очередь поддерживают антимикробные реакции, рекрутирование нейтрофилов и усиленный обмен тканей. В целом, у здоровых мы наблюдаем, что стромальные клетки десны связаны с индукцией воспалительных реакций и рекрутированием нейтрофилов. Действительно, слизистая оболочка десен является местом постоянной трансмиграции нейтрофилов 3 .Важно отметить, что мы обнаружили, что стромальные клетки особенно активируются в условиях пародонтита, способствуя привлечению и миграции иммунных клеток в очаги заболевания. При заболевании фибробласты и другие стромальные клетки способствуют специфическому набору нейтрофилов, но также экспрессируют хемокины, которые, как известно, привлекают другие лейкоциты, включая лимфоциты. Эти находки указывают на ранее непризнанную роль мезенхимального компартмента в иммунном ответе в оральном гомеостазе и патогенезе заболевания, подобно недавним находкам, которые идентифицируют мезенхимально-воспалительную ось при заболеваниях других тканевых компартментов 33,34 .Важно отметить, что незарегистрированный аспект гиперреактивности стромы при здоровье и заболевании слизистой оболочки десны — это особая спецификация стромальных клеток десны в отношении рекрутирования нейтрофилов.

Наши результаты также подтверждают критическую роль нейтрофилов в иммунитете слизистой оболочки полости рта. Мы документально подтверждаем, что многие иммунные пути, активируемые в стромальных и эпителиальных клетках при здоровье и заболевании десен, связаны с хоумингом нейтрофилов. На самом деле, некоторые из наиболее активируемых генов в стромальных и эпителиальных клетках десны включают CSF3, CXCL1, CXCL2 и CXCL8 , которые специфичны для рекрутирования нейтрофилов.Действительно, в стационарном состоянии нейтрофилы представляют собой тип иммунных клеток со значительно более высокой представленностью последовательностями scRNA в слизистой оболочке полости рта по сравнению со всеми другими исследованными барьерными тканями здорового человека. При заболеваниях пародонта мы дополнительно документируем значительное привлечение нейтрофилов в тканевые поражения с помощью проточной цитометрии, что действительно является хорошо изученным феноменом 35,36 . scRNA seq фиксирует увеличение тканевых нейтрофилов при пародонтите, хотя и не достигая статистической значимости.Это указывает на технические ограничения в захвате ответов тканевых нейтрофилов, вероятно, из-за резкого падения транскрипционной активности зрелых нейтрофилов после выхода из костного мозга, а также чувствительности нейтрофилов во время этапов подготовки и выделения тканей 14 . Наконец, экспрессия известных генов предрасположенности к заболеваниям в тканях полости рта отражает преобладающую экспрессию генов, ассоциированных с менделевскими заболеваниями, в тканевых нейтрофилах. Действительно, хорошо известно, что у пациентов с генетическими дефектами нейтрофилов обычно развиваются тяжелые оральные фенотипы, включая агрессивный пародонтит у детей и рецидивирующие язвы на слизистой оболочке полости рта 15,37 .Кроме того, наш атлас позволяет нам оценить экспрессию генов, связанных с предрасположенностью пародонта к распространенным формам пародонтита, выявленным в исследованиях GWAS. Экспрессия генов восприимчивости в интересующей ткани выявляет экспрессию клеток в различных клеточных популяциях и открывает возможности для исследования различных путей патогенеза при распространенных формах заболеваний.

Наконец, мы использовали наш атлас для изучения экспрессии микробных рецепторов и молекул, чувствительных к повреждениям, в слизистой оболочке полости рта.На этом барьере в здоровом состоянии присутствует богатый комменсальный микробиом, который может участвовать в тканевом гомеостазе и, несомненно, участвует в патогенезе распространенных заболеваний слизистой оболочки полости рта, включая пародонтит, кандидоз и язвы полости рта, что предполагает основную роль взаимодействия хозяина и микробов в тканях полости рта. патофизиология. Кроме того, поскольку многие комменсалы и патогены сначала встречаются на слизистой оболочке полости рта до попадания в желудочно-кишечный тракт и дыхательные пути, понимание первоначального распознавания микробных элементов на этом барьере становится особенно важным.Кроме того, жевательная слизистая оболочка, включая десны, постоянно подвергается механическому стрессу и повреждению клеток при жевании 38 . Поэтому мы создали атлас экспрессии основных бактериальных, грибковых и вирусных рецепторов и сенсорных молекул в клеточных популяциях слизистой оболочки полости рта. Мы определяем различную экспрессию рецепторов на участках слизистой оболочки щек и десен, что потенциально отражает уникальную восприимчивость к заболеваниям и инфекциям на каждом оральном барьере. Кроме того, модуляция микробной экспрессии при пародонтите предполагает изменение взаимодействия между хозяином и микробами при наличии воспаления.Важно отметить, что экспрессия микробных чувствительных и повреждающих рецепторов в стромальных клетках и дальнейшая активация таких рецепторов в условиях заболевания поддерживает концепцию о том, что стромальный компартмент получает разнообразные микробные и повреждающие сигналы, способствующие гомеостатическому воспалению, но при обострении вызывает воспалительную деструкцию ткани и болезнь.

В совокупности наш атлас тканей слизистой оболочки полости рта дает всестороннюю характеристику клеточных популяций и состояний в норме и при пародонтите, а также дает представление о функциональности клеток и межклеточных взаимодействиях в патогенезе заболевания.Кроме того, наша работа раскрывает уникальную функциональность популяций стромальных клеток, участвующих в гомеостатическом иммунитете и воспалении на этом барьере.

Методы

Исследования на людях

Набор пациентов и этическое одобрение

Все здоровые добровольцы и пациенты, участвовавшие в этом исследовании, были включены в клинический протокол, утвержденный IRB в Клиническом центре NIH (ClinicalTrials.gov #NCT01568697), и предоставили письменное информированное согласие за участие в этом исследовании.Все участники были признаны системно здоровыми на основании подробного анамнеза и результатов некоторых лабораторных исследований.

Критериями включения в это исследование были: возраст ≥ 18 лет, минимум 20 естественных зубов и хорошее общее состояние здоровья. Критерии исключения: гепатит B или C в анамнезе, ВИЧ-инфекция в анамнезе, лучевая терапия головы или шеи в анамнезе, активное злокачественное новообразование, за исключением локализованной базальноклеточной или плоскоклеточной карциномы кожи, системная химиотерапия или лучевая терапия в течение 5 лет, беременность или кормление грудью, диагноз сахарного диабета и/или уровень HbA1C> 6%, > 3 госпитализаций за последние 3 года, аутоиммунное заболевание, такое как волчанка, ревматоидный артрит и т. д.Дополнительные критерии исключения включали использование любого из следующего в течение 3 месяцев до включения в исследование: системные (внутривенные, внутримышечные или пероральные) антибиотики, пероральные, внутривенные, внутримышечные, интраназальные или ингаляционные кортикостероиды или другие иммунодепрессанты, цитокиновая терапия, метотрексат или иммуносупрессивные химиотерапевтические средства, большие дозы коммерческих пробиотиков (более или равные 10 8 колониеобразующих единиц или организмов в день) или употребление табачных изделий (включая электронные сигареты) в течение 1 года после скрининга.В дополнение к системному скринингу оценивалось состояние полости рта, и только участники без поражений мягких тканей, без признаков/симптомов оральной/зубной инфекции и без/минимального воспаления десен были включены в группу здоровья. Критериями включения в группу заболеваний пародонта были периодонтит от умеренной до тяжелой степени (глубина зондирования > 5 мм в более чем 4 интерпроксимальных участках) и видимые признаки воспаления тканей, включая эритему/отек и кровотечение при зондировании.

Взятие биопсии

Во время учебных посещений участники проходили подробное интраоральное обследование мягких тканей и пародонта, которое включало полное зондирование полости рта и определение клинической потери прикрепления (PD, показатели разрушения кости) и кровотечения при зондировании (BOP, показатель воспаления слизистой оболочки) .Под местной анестезией были получены стандартизированные биопсии десневого воротничка размером 4 мм и шириной 2 мм и/или буккальные биоптаты размером 4 мм. Щечные и десневые биопсии группы здоровья были получены у лиц, которые соответствовали критериям здоровья полости рта и в областях без BOP и с PD <3 мм. Биопсии пациентов с пародонтитом были получены из областей сильного воспаления и потери костной массы (BOP-положительный и PD> 5 мм). Каждая биопсия анализировалась отдельно и не объединялась. Биоптаты либо помещали в среду RPMI для обработки в виде суспензии отдельных клеток, либо фиксировали 10% цинковым формалином (American MasterTech Scientific) для гистологии.Информацию о донорах можно найти в дополнительной таблице 1.

Гистология

Для гистологии ткани помещали в цинковый формалин на 18-24 часа, а затем формалин заменяли 70% этанолом (Sigma). Фиксированные формалином ткани заливали в парафин и делали срезы по 5 мм, депарафинизировали и регидратировали с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) и иммунофлуоресцентным окрашиванием. Иммунофлуоресценцию проводили с помощью выделения антигена при нагревании с буфером Трис-ЭДТА (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 9.0) в скороварке Retriever 2100 (Electron Microscopy Sciences). Предметные стекла инкубировали в течение ночи при 4°C со следующими первичными антителами: анти-виментин (abcam, ab24525, разведение 1:100), анти-CD45 (Cell Signaling, 13917, 1:100), анти-CD31 (Cell Signaling, 3528). , 1:250) и антикератин 5 (LSBio, LS-C22715, 1:500). Вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor, использовались для обнаружения первичных антител (ThermoFisher, Alexa 488, 546, 594 и 647, все вторичные антитела в разведении 1:300) и ядер, окрашенных DAPI (ThermoFisher, 1 мкг/мл) перед покрытие ProLong Gold Antifade Mountant (ThermoFisher).Слайды визуализировали на Leica TCS SP8 X (Leica), расположенном в Национальном институте артрита, заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи (NIAMS) Light Imaging Core, и обрабатывали с помощью программного обеспечения LAS X (Leica).

Подготовка биопсии к суспензии одиночных клеток

10X

Для приготовления суспензии одиночных клеток биоптаты измельчали ​​и расщепляли с использованием коллагеназы II (Worthington Biochemical Corporation) и ДНКазы (Sigma) и обрабатывали диссоциатором softMACS (Miltenyl) с использованием протокола слизистой оболочки носа. для обработки 39 .После диссоциации ткани клетки пропускали через фильтр 70 мкм (Falcon, Corning), промывали и подсчитывали с помощью Cellometer Auto 2000 (Nexcelom).

Проточная цитометрия

Ткани десны человека измельчали ​​и расщепляли в течение 50 минут при 37°C с помощью коллагеназы IV (Gibco) и ДНКазы (Sigma). Затем получали суспензию одиночных клеток путем протирания расщепленных образцов через фильтр 70 мкм (Falcon, Corning), как описано ранее 35 .

Проточная цитометрия образцов тканей слизистой оболочки полости рта человека

Суспензии одиночных клеток из тканей десны инкубировали с мышиной сывороткой (Jackson ImmunoResearch Lab) и конъюгированными с флуорохромом антителами против поверхностных маркеров в PBS с 2.5% FBS, в течение 20 минут при 4°С в темноте, а затем промывают. Мертвые клетки удаляли фиксируемым красителем Live/Dead (Amcyan, 1:100, Invitrogen). Информация об антителах человека, использованная для окрашивания, описана в дополнительной таблице 9. Получение клеток проводили на машине BD LSRFortessa с использованием программного обеспечения FACSDiVa (BD Biosciences). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar).

10X Sequencing

Суспензии одиночных клеток загружали в 10X Chromium Controller (10X Genomics) и выполняли подготовку библиотеки в соответствии с инструкциями производителя набора 10X Chromium Next GEM Single Cell Library v3 (10X Genomics).Затем библиотеки объединяли в группы по 4 и секвенировали на 4 дорожках на секвенаторе NextSeq500 (Illumina) с использованием рекомендованной конфигурации чтения 10X Genomics.

10X Импорт данных

Для пероральных наборов данных отфильтрованные матрицы штрих-кодов, сгенерированные конвейером cellranger, использовались в качестве входных данных в формат, совместимый с Seurat, с использованием функций «Read10X» и «CreateSeuratObject».

Для ранее опубликованных наборов данных кожи 11 , легких 13 и подвздошной кишки 12 файлы, загруженные из GEO Accession Viewer, были извлечены и импортированы в Seurat-совместимый объект.Весь контроль качества, нормализация и последующий анализ выполнялись с использованием пакета R Seurat 40 (версия 3.2.2, https://github.com/satijalab/seurat), если не указано иное.

10X Контроль качества данных, нормализация и интеграция

Клетки были отфильтрованы для удаления клеток с экспрессией менее 200 генов, более 5000 генов и клеток с экспрессией митохондриальных генов более 15%. Этапы нормализации выполнялись с использованием функции Сера «NormalizeData».Всего было выполнено три уникальных интеграции наборов данных для анализа данных с использованием функций Seurat «FindIntegrationAnchors» и «IntegrateData»: 1. состояние полости рта и десен, 2. состояние и заболевание десен и 3. состояние полости рта (здоровье полости рта и десен), кожа , легкие и подвздошная кишка. Для третьей группы образцов, описанных выше, все когорты были случайным образом уменьшены с использованием базовой R-функции «выборка», так что каждая группа (ротовая, кожа, легкие, подвздошная кишка) содержала одинаковое количество клеток для глобального сравнения.

Уменьшение размерности в 10 раз, кластеризация ячеек и идентификация

Чтобы выбрать главный компонент (PC), который объясняет наибольшую дисперсию, дисперсия, вносимая каждым PC, была визуализирована с использованием графика колена. Затем для последующего анализа использовались информативные ПК. Кластеризация Лувена выполнялась с помощью функции FindClusters с использованием первых 50 ПК. Дифференциальную экспрессию генов использовали для ручной аннотации кластеров (функция FindAllMarkers). Транскриптомную сигнатуру иммунных клеток дополнительно исследовали с использованием эталонной транскриптомной базы данных Monaco 41 чистых типов клеток через SingleR 42 (ver.1.0.6, https://github.com/dviraran/SingleR). Чтобы устранить перекрытие отдельных клеток, которое может запутать паттерны экспрессии генов, UMAP для выбранных подтипов клеток были разбиты на мозаику с помощью регулярной сетки шестиугольников, было подсчитано количество клеток в каждом шестиугольнике, а средняя экспрессия клеток в каждом шестиугольнике была представлена цветовая шкала через schex (версия 1.0.55, https://github.com/SaskiaFreytag/schex).

10X Анализ путей и вывод сигналов рецептор-лиганд

Анализ чрезмерной репрезентативности наборов генов со значительной активацией генов, определяющих кластеры, был выполнен с использованием пакета gsfisher R (ver.0.2, https://github.com/sansomlab/gsfisher/) и отфильтрованы, чтобы включить только наборы генов «биологического процесса», полученные из базы данных GO.

Для прогнозирования межклеточных взаимодействий с использованием данных об экспрессии мы использовали NicheNet 43 (версия 1.0.0, https://github.com/saeyslab/nichenetr), в котором были объединены данные об экспрессии генов клеток из нашей группы секвенирования с база данных предшествующих знаний о сигнальных и генных регуляторных сетях. Интегрированный объект Seurat, содержащий здоровую и пораженную ткань десны, использовался в качестве входных данных для оболочки NicheNet Seurat («nichenet_seuratobj_aggregate»).

Статистика

Для оценки значимости изменений пропорций между типами тканей и результатов проточной цитометрии, если обе группы образцов проходили критерий нормальности Шапиро-Уилка, использовали непарный t-критерий с поправкой Уэлча. Если одна или несколько групп не прошли тест на нормальность, использовали тест Манна-Уитни. При оценке дифференциально экспрессируемых генов с помощью Seurat использовали непараметрический критерий суммы рангов Уилкоксона.

Вклад авторов

DWW и NMM задумали исследование и написали рукопись.DWW, TGW, LB, ND участвовали в сборе и подготовке образцов, экспериментах и ​​анализе с помощью проточной цитометрии. DWW провел анализ данных 10-кратного увеличения и подготовил все рисунки. OA, APS выполнили гистологическое окрашивание. SW, DM, MH, KD, GH консультировались по экспериментам и анализу данных, критически рецензировали и редактировали рукопись. NMM руководил исследованием.

Дополнительные пояснения к рисункам

Дополнительный рисунок 1 (связанный с рисунком 1). . Скрипичные графики, показывающие количество признаков, количество РНК и процент митохондриальных транскриптов, обнаруженных в образцах пациентов со здоровьем десен (GM), здоровьем полости рта (BM) и заболеваниями пародонта (PD) до контроля качества. б . Скрипичные графики, показывающие количество признаков, количество РНК и процент митохондриальных транскриптов после контроля качества. с . Гистограммы, показывающие количество клеток, которые были первоначально секвенированы (до контроля качества), и количество клеток, включенных в анализ (после контроля качества) для каждого образца пациента. д . Тепловая карта, показывающая среднюю Z-оценку экспрессии основных дифференциально регулируемых генов для основных типов клеток, идентифицированных в здоровых тканях десны и щеки.

Дополнительный рисунок 2 (связанный с рисунком 2).. UMAP отображает количество кластеров, идентифицированных в здоровой десне и щечной ткани с помощью алгоритма кластеризации Seurat с разрешением 1. Кластеры 17 и 30 были загрязнены эритроцитами и были удалены из набора данных перед анализом. б-д . Тепловые карты, изображающие среднюю экспрессию гена для каждого гена, связанного с термином GO справа, который был обогащен в каждом отдельном кластере эндотелия (b) , эпителия (c) и фибробласта (d) .

Дополнительный рисунок 3 (связанный с рисунком 3). . Пример стратегии стробирования для анализа проточной цитометрии на рисунке 3h. б . Графики пропорций, показывающие процентное содержание каждого типа иммунных клеток в каждой барьерной ткани. **p<0,01 на основе однофакторного дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Даннета

Дополнительный рисунок 4 (относится к рисунку 4,5). . UMAP, отображающий количество кластеров, идентифицированных в здоровой и пораженной ткани десны с помощью алгоритма кластеризации Сера с разрешением 1.Кластеры 17, 24 и 29 были загрязнены эритроцитами и были удалены из набора данных перед анализом. до н.э. . Иммуногистохимия здоровых тканей (б) и пародонтита (в) , окрашенных миелопероксидазой, ферментом, обильно экспрессируемым нейтрофилами. Масштабная линейка: 100 мкм.

Дополнительный рисунок 5 (связанный с рисунком 6). а-с . Точечные графики, изображающие экспрессию генов, определяющих кластер, и процент клеток, экспрессирующих каждый ген, для эндотелиальных (a) , эпителиальных (b) и фибробластных (c) популяций соответственно.Значения экспрессии представляют собой средние Z-баллы.

Дополнительный рисунок 6 (связанный с рисунком 6). . Точечный график, показывающий специфичную для тканей и клеток экспрессию главных лигандов, идентифицированных NicheNet. б . Точечный график, показывающий экспрессию рецепторов иммунными клетками пародонтита, идентифицированных NicheNet. с . Тепловая карта предшествующего потенциала взаимодействия между рецепторами и лигандами, идентифицированная NicheNet и использованная для создания аллювиальных графиков на рисунке 6g. д . Тепловая карта предполагаемых нижестоящих генов, которые регулируются связыванием лиганда, оцененная по предыдущей модели в NicheNet.

Дополнительный рисунок 7 (связанный с рисунком 6). . Точечные диаграммы экспрессии хемокинового рецептора в иммунных клетках в норме и при заболевании (слева) и экспрессии экспрессии хемокинового лиганда в общих типах клеток в норме и при заболевании (справа). Цветные линии, идущие от рецепторов к лигандам, обозначают известные взаимодействия. Экспрессия рецепторов хемокинов была упрощена на фигуре 6h на основе этого точечного графика.

Дополнительный рисунок 8 (связанный с рисунком 7). а-б .Точечные диаграммы, показывающие экспрессию TLR (зеленый), NLR (коричневый), CLR/RLR (оранжевый), DAMP (синий), DAMP-рецепторов (голубой), факторы проникновения вируса SARS-CoV-2 (красный) и факторы проникновения вируса для вирусы, вызывающие оральную патологию (фиолетовые) в основных типах клеток здоровья десен и щек (a) и в здоровье и заболеваниях десен (b) .

Дополнительные таблицы

Таблица S1: Демографические данные всех пациентов, проанализированных с помощью секвенирования одноклеточной РНК Список определяющих кластер генов для основных типов иммунных клеток, указанных на рисунке 3

Таблица S4: Демографические данные всех пациентов, проанализированных с помощью проточной цитометрии

Таблица S5: Список информации о путях онтологии генов, описанной на рисунке 6

Таблица S6: Информация о клетках и источниках для сравнительного анализа секвенирования отдельных клеток барьерных тканей.Сравнение здоровых десневых и щечных тканей.

Таблица S8: Результаты теста суммы рангов Уилкоксона для экспрессии PRR, DAMP, DAMP-R и факторов проникновения вируса. Сравнение здоровых и пораженных тканей десны.

Таблица S9: Список антител

Благодарности

Это исследование частично финансировалось за счет внутренних программ NIH/NIDCR (NMM) и NIH/NIAMS (MM), за счет заочных грантов NIH/NIDCR DE025046 (KD), DE029436 и DE028561 (GH), FONDECYT № 11180389 через Национальное агентство исследований и разработок (ANID), Чили (ND), и аспирантуру от Barbour Foundation (SW).MH финансируется Wellcome (WT107931/Z/15/Z), Институтом профилактической медицины Листера и Центром биомедицинских исследований Ньюкасла NIHR (BRC). Эта работа также стала возможной благодаря использованию ядра геномики и вычислительной биологии (NIDCR, ZIC DC000086) и ядра комбинированных технических исследований (NIDCR, ZIC DE000729-09). Иллюстрации рисунков были частично созданы с помощью Biorender.