Кафедра стоматологии АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития Чувашии сообщает о проведении 3 февраля 2012 г. лекции «Заболевания пародонта»

Лекция состоится в конференц-зале кафедры стоматологии АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» по адресу г. Чебоксары, ул. М. Сеспеля, д. 27, 2 этаж. января 2012 г

Начало в 10.00

Программа лекции

1. Современная классификация болезней пародонта

2. Распространенность заболеваний пародонта (по данным ВОЗ и РФ)

3. Строение пародонта

4. Этиология воспалительных заболеваний пародонта.

Определение микробной бляшки, биоциноза. Факторы иммунной защиты. Факторы риска развития воспалительных заболеваний пародонта.

5. Гингивит — формы по МКБ-10

6. Катаральный гингивит, этиология клиника, диагностика, лечение. Дифференциальная диагностика с десквамативным гингивитом. Клиника заболеваний слизистой оболочки рта, сопровождающиеся десквамативным гингивитом.

7. Язвенный гингивит, этиология, клиника, диагностика, лечение. Дифференциальная диагностика с язвенно-некротическим гингиво-стоматитом Венсана, острым герпетическим гингиво-стоматитом, гингивитом при отравлении солями тяжелых металлов.

8. Гиперпластический гингивит. Этиологические факторы. Клиника гингивита беременных, медикаментозных гингивитов, лечение. Дифференциальная диагностика.

9. Пародонтит. Классификация. Ведущие этиологические факторы в развитии хронического пародонтита, в развитии агрессивных форм пародонтита. Принципы медикаментозного и хирургического лечения.

Современные антисептики. Современные оперативные методы

лечения, направленные на устранение пародонтального кармана и

коррекцию мягких тканей (кюретаж, лоскутная операция, направленная

регенерация, френулотомия, френулэктомия).

10. Значение подготовительного этапа в подготовке к хирургическому лечению. Показания к назначению антибиотиков перед оперативным вмешательством.

11. Рецессия десны. Этиология. Принципы оперативного лечения.

12. Лечение обострения агрессивных форм пародонтита (абсцедирование).

13. Схема поддерживающей терапии воспалительных заболеваний пародонта.

14. Профилактика воспалительных заболеваний пародонта. Современные методы и средства.

15. Значение пробиотиков в профилактике и лечении воспалительных заболеваний пародонта.

Лектор —Аксамит Людмила Анатольевна, к.м.н., доцент кафедры стоматологии общей практики и анестезиологии Московского государственного медико-стоматологического университета.

Справки по тел. (8352) 58-27-60 (кафедра)

Микробные признаки здоровья, гингивита и периодонтита

В поддесневой щели обитают разнообразные микробные сообщества. Сдвиги в составе этих сообществ происходят при развитии гингивита и пародонтита, которые рассматриваются как последовательные стадии ухудшения здоровья пародонта. Однако неясно, в какой степени микробиота, связанная со здоровьем и гингивитом, является защитной, и способствуют ли эти сообщества последовательному росту таксонов, связанных с пародонтитом.Чтобы углубить наше понимание динамики микробных стимулов, вызывающих нарушения гомеостаза пародонта, мы проанализировали доступную литературу с целью определения специфических микробных сигнатур, связанных с различными стадиями дисбактериоза пародонта. Хотя в нескольких исследованиях оценивались поддесневые сообщества, присутствующие при различных состояниях пародонта, мы нашли ограниченные доказательства для прямого сравнения сообществ в состоянии здоровья, гингивита и пародонтита. Поэтому мы стремились лучше определить сдвиги поддесневого микробиома путем слияния и повторного анализа, используя унифицированные стратегии биоинформационной обработки, общедоступные наборы данных ампликонов генов 16S рибосомной РНК о здоровье пародонта, гингивите и пародонтите.Несмотря на характерные методологические различия между исследованиями, были обнаружены различные структуры сообщества для здоровья, гингивита и пародонтита, что демонстрирует специфические связи между состоянием ткани десны и поддесневым микробиомом. В соответствии с концепцией о том, что дисбактериоз пародонта является результатом процесса микробной сукцессии без замещения, при заболевании было обнаружено больше видов, чем в норме. Однако сообщества, связанные с гингивитом, были более разнообразными, чем у пациентов с пародонтитом, что позволяет предположить, что определенные виды в конечном итоге становятся доминирующими по мере прогрессирования дисбактериоза.Мы определили виды бактерий, связанные с каждым состоянием пародонта, и преобладающие виды, численность которых не меняется от одного состояния к другому (основные виды), а также наметили закономерности совместного появления видов с помощью сетевого анализа. Большинство видов, связанных с пародонтитом, редко выявлялись у здоровых людей, но часто обнаруживались, хотя и в небольшом количестве, при гингивите, что позволяет предположить, что гингивит и пародонтит представляют собой континуум. В целом, мы предоставляем основу для изменений поддесневого микробиома, которую можно использовать для создания гипотез в отношении процессов сборки сообщества и возникновения дисбиоза пародонта.

Ключевые слова: 16S рРНК; дисбактериоз; гингивит; микробиом; здоровье пародонта; периодонтит.

Сигнатура лечения гингивита на основе микробиоты: рандомизированное исследование

Развитие бактериального сообщества при экспериментальном гингивите

Abstract

Современные знания о микробном составе зубного налета при раннем гингивите в основном основаны на микроскопии и культуральных методах, которые не дают исчерпывающего описания микробных сообществ полости рта.В этом исследовании использовалось 454-пиросеквенирование области V1–V3 генов 16S рРНК (приблизительно 500 п.н.) и бактериальная культура, чтобы охарактеризовать состав зубного налета во время перехода от здорового пародонта к гингивиту. В общей сложности 20 здоровых добровольцев воздерживались от гигиены полости рта в течение двух недель, что привело к накоплению зубного налета и развитию гингивита. Образцы зубного налета анализировали в начале исследования, а также через одну и две недели. Кроме того, образцы зубного налета от 20 пациентов с хроническим пародонтитом были проанализированы для поперечного сравнения с когортой пациентов с экспериментальным гингивитом.У всех здоровых добровольцев через две недели развился гингивит. Пиросеквенирование дало в итоге 344 267 последовательностей после фильтрации со средней длиной 354 основания, которые были сгруппированы в среднем в 299 операционных таксономических единиц (OTU) на уровне вида на образец. Графики анализа основных координат (PCoA) выявили значительные сдвиги в структуре бактериального сообщества зубного налета по мере индуцирования гингивита, а разнообразие сообщества значительно увеличилось через две недели. Изменения в относительном количестве OTU при переходе от состояния здоровья к гингивиту коррелировали с показателями кровоточивости при зондировании (BoP) и привели к выявлению новых таксонов, связанных со здоровьем и гингивитом.Сравнение здоровых добровольцев с больными пародонтитом также подтвердило связь ряда предполагаемых пародонтопатогенов с хроническим пародонтитом. Таксоны, связанные с гингивитом, включали Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum , Lachnospiraceae [G-2] sp. HOT100, Lautropia sp. HOTA94 и Prevotella oulorum, , в то время как Rothia dentocariosa были связаны со здоровьем пародонта. Дальнейшее изучение этих таксонов оправдано и может привести к новым терапевтическим подходам для предотвращения заболеваний пародонта.

Образец цитирования: Кистлер Д.О., Бут В., Брэдшоу Д.Дж., Уэйд В.Г. (2013) Развитие бактериального сообщества при экспериментальном гингивите. ПЛОС ОДИН 8(8): е71227. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227

Редактор: Майкл Глогауэр, Университет Торонто, Канада

Получено: 3 апреля 2013 г.; Принято: 27 июня 2013 г.; Опубликовано: 14 августа 2013 г.

Авторское право: © 2013 Kistler et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано BBSRC Industrial Case Studentship ref no. BB/G01714X/1 в сотрудничестве с GlaxoSmithKline. BBSRC не участвовал в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.GlaxoSmithKline участвовала в планировании исследования и подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Дэвид Брэдшоу является сотрудником GlaxoSmithKline. Это не меняет приверженности авторов всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами. Авторы заявили, что других конкурирующих интересов не существует.

Введение

Гингивит — это обратимая форма заболевания пародонта, характеризующаяся воспалением десен в ответ на зрелую биопленку зубного налета.У предрасположенных лиц персистирующий гингивит может привести к хроническому пародонтиту [1], вызывающему необратимое разрушение тканей пародонта. В настоящее время основными средствами профилактики являются такие методы гигиены полости рта, как чистка зубов щеткой, чистка межзубных промежутков и использование противомикробных ополаскивателей для полости рта. Многие люди не соблюдают гигиену полости рта в соответствии со стандартами, достаточными для предотвращения гингивита, и поэтому желательны альтернативные профилактические стратегии. В последнее время появился интерес к возможности использования пробиотиков или пребиотиков, направленных на укрепление здоровья пародонта путем поддержания состояния зубного налета в состоянии, связанном со здоровьем [2]–[4].Однако в первую очередь требуется более полное знание бактериального состава зубного налета в норме и изменений, происходящих на начальных стадиях гингивита. Микробиота, связанная с хроническим пародонтитом, была исследована более глубоко и недавно стала предметом обширного обзора [5].

Существенная роль зубного налета в развитии гингивита была впервые показана на модели «экспериментального гингивита» [6], [7]. Используя микроскопию, исследователи отметили изменения в преобладающих бактериальных морфотипах, присутствующих в зубном налете, при переходе от здорового состояния к гингивиту.В частности, они сообщили, что ранний зубной налет у здоровых людей состоял из относительно простого бактериального сообщества, в котором преобладали грамположительные кокки и палочки. По мере созревания зубного налета и развития гингивита сообщества становились все более сложными с увеличением доли грамотрицательных палочек, веретенообразных, филаментов, спирилл и спирохет. Более поздние экспериментальные исследования гингивита с использованием культуры подтвердили эти выводы и предоставили больше информации о конкретных видах бактерий, присутствующих в зубном налете [8]–[10].Однако было подсчитано, что примерно половина бактерий, обнаруженных в полости рта, не была или не может быть культивирована в лаборатории [11]. Поэтому одни только культуральные исследования не могут дать исчерпывающего описания микробиоты при экспериментальном гингивите.

Внедрение независимых от культуры молекулярных методов для идентификации бактерий, присутствующих в сложных образцах, таких как методы, основанные на клонировании и секвенировании по Сэнгеру генов 16 S рибосомной РНК, значительно расширило наши знания о бактериальных сообществах полости рта в норме и при патологии [12]. .Аас и др. [13] использовали этот подход для характеристики бактериальных сообществ в девяти различных участках полости рта у пяти здоровых людей и обнаружили от 34 до 72 различных филотипов на уровне видов на человека. Авторы обнаружили, что определенные филотипы проявляли специфичность к месту и предмету, в то время как другие, такие как Streptococcus mitis и Granulicatella adiacens , были обнаружены у большинства субъектов и участков, отобранных для исследования. Так называемый «красный комплекс» предполагаемых пародонтальных патогенов ( Porphyromonas gingivalis , Tannerella forsythia и Treponema denticola ), ранее ассоциированных с хроническим пародонтитом, и друг с другом на основе шахматной ДНК-ДНК гибридизации [14] , не были обнаружены.Интересно, однако, что аналогичное более позднее исследование микробиоты у 10 здоровых людей выявило все три вида «красных комплексов» в небольших количествах [15]. Ни в одном из предыдущих исследований не использовалось клонирование и секвенирование гена 16S рРНК для характеристики микробиоты при экспериментальном гингивите.

В то время как клонирование гена 16S рРНК и секвенирование по Сэнгеру, несомненно, были полезными, они страдают от относительно низкой производительности, и исследователи обычно секвенировали ограниченное количество клонов на образец (часто ≤100) [13], [16].В последние годы технологии секвенирования следующего поколения привели к значительному улучшению глубины и масштаба исследований секвенирования генов 16S рРНК [17]. Используя 454-пиросеквенирование генов 16S рРНК, Griffen [18] et al. и Абуслеме и др. [19] недавно сравнили поддесневые бактериальные сообщества пациентов с хроническим пародонтитом и здоровых людей. В обоих случаях авторы выявили значительные различия между когортами с точки зрения состава и структуры их поддесневых сообществ и сообщили о более высоком бактериальном разнообразии при заболевании.Кроме того, авторы выявили ассоциации между конкретными таксонами бактерий и заболеванием. Виды «красного комплекса» были связаны с заболеванием в обоих исследованиях. Интересно, однако, что они также идентифицировали ряд дополнительных видов, которые показали связь с хроническим пародонтитом. Filifactor alocis и Treponema medium были среди тех таксонов, которые наиболее тесно связаны с заболеванием в обоих исследованиях. В одном исследовании с пиросеквенированием 454 изучались различия бактериальных сообществ в слюне и зубном налете трех здоровых людей и трех человек с гингивитом [20].Сообщества в зубном налете, но не в слюне, значительно различались между здоровыми и больными гингивитом, и количество OTU на уровне видов в зубном налете было больше или меньше у людей с гингивитом по сравнению со здоровыми людьми. Многие из OTU, связанных с гингивитом, были идентифицированы как представители родов Leptotrichia и Selenomonas , хотя в большинстве случаев отнесение на видовой уровень не проводилось. Однако одним из ограничений этого и других перекрестных исследований является то, что в микробиоме полости рта были обнаружены большие межиндивидуальные вариации, особенно на уровне видов [21]–[23].

Это исследование было направлено на использование модели продольного экспериментального гингивита, высокопроизводительного пиросеквенирования 16S рРНК и методов неселективного культивирования для всесторонней характеристики бактериальных сообществ в зубном налете при переходе от здорового к экспериментально индуцированному гингивиту. Кроме того, образцы зубного налета из группы пациентов с тяжелым пародонтитом были подвергнуты пиросеквенированию для поперечного сравнения со здоровой группой. Анализы были направлены на выявление конкретных таксонов бактерий, связанных со здоровьем пародонта и начальными стадиями гингивита.

Материалы и методы

Вербовка субъекта

Этическое одобрение исследования было предоставлено Комитетом по этике исследований Юго-Восточного Лондона 1 (бывший REC Гая), и от всех участников было получено информированное согласие. Все пациенты и субъекты, включенные в исследование, имели не менее 20 зубов и были системно здоровыми и не принимали антибиотики в анамнезе по крайней мере за три месяца до исследования. Беременные женщины, нынешние курильщики или лица, бросившие курить в течение предыдущих пяти лет, не включались.

Пародонтологически здоровые добровольцы.

Набран клинический персонал Лондонского стоматологического института Королевского колледжа. У всех набранных субъектов не было признаков пародонтита и уже было лишь минимальное воспаление десен без необходимости профессионального вмешательства. BPE (Basic Periodontal Examination) использовался для скрининга потенциальных субъектов. У испытуемых не было баллов BPE выше двух ни в одном из секстантов, ни потери прикрепления при зондировании, ни кровоточивости менее 15% участков после зондирования, ни признаков рецессии десны.Все клинические обследования проводились одним и тем же квалифицированным стоматологом.

Больные хроническим пародонтитом.

Пациенты были зарегистрированы из числа пациентов, направленных на лечение в отделение пародонтологии Фонда Гая и Святого Томаса. У всех пациентов было не менее 20 зубов, и у них был диагностирован тяжелый хронический пародонтит [24]. У каждого пациента было не менее шести зубов с глубиной зондирования ≥6 мм и потерей костной массы. У пациентов было не менее 20 зубов и не менее шести зубов с глубиной зондирования ≥6 мм.

Экспериментальный гингивит

Краткое изложение плана экспериментального исследования гингивита показано на рисунке 1. Субъектам было дано указание воздерживаться от любых методов чистки зубов на нижней челюсти в течение двух недель. Мягкий акриловый стент был изготовлен для покрытия зубов нижней челюсти во время чистки зубов верхней челюсти и удален сразу после чистки. Мягкий стент можно было легко вставлять и удалять, не нарушая формирующийся налет, в то же время гарантируя, что субъекты не смогут чистить зубы нижней челюсти и, таким образом, нарушить образование налета.Исходно и через две недели были прозондированы шесть участков/зуб и оценена кровоточивость при зондировании (BoP). Зондирования после одной недели накопления налета избегали, поскольку кровотечение в расщелине могло повлиять на развивающуюся биопленку. Тем не менее, во все моменты времени неинвазивные образцы жидкости десневой борозды (GCF) собирались перед клиническими измерениями или взятием образцов зубного налета, поскольку было показано, что объем GCF увеличивается до развития клинически очевидного воспаления, например. БоП.Было зарегистрировано количество участков с четко видимым налетом (индекс налета Силнесса и Лоэ = 2 [25]). Через две недели все испытуемые отполировали зубы и возобновили нормальную гигиену полости рта.

Коллекция образцов

Экспериментальный гингивит.

Исходно, после сбора GCF и клинических измерений, образцы зубного налета были собраны с помощью стерильной кюретки со всех зубов нижней челюсти у здоровых добровольцев, за исключением третьих моляров.Образцы зубного налета собирали с помощью стерильной кюретки непосредственно над десневым краем и из десневых щелей в 1 мл стерильного 0,1x трис-ЭДТА, и зубной налет со всех участков тела пациента объединяли. На протяжении всего исследования использовался один и тот же метод сбора, чтобы гарантировать сопоставимость образцов. GCF собирали из мезиобуккальных участков 12 зубов нижней челюсти на перио-бумажные полоски, а объем жидкости оценивали с помощью Periotron 8000. Образцы зубного налета и GCF снова собирали через одну и две недели накопления зубного налета.Зубной налет собирали с зубов на одной половине нижней челюсти через одну неделю, а на другой половине – через две недели.

Хронический пародонтит.

Образцы поверхностного зубного налета собирали так же, как и у здоровых людей. У 14 из 20 пациентов были взяты отдельные образцы поддесневого налета путем введения кюретки на всю глубину карманов >6 мм после того, как был собран поверхностный налет. Эти участки были выбраны на основе глубины кармана, чтобы представить микробную среду обитания, явно отличающуюся от поверхностных образцов, и конкретные выбранные участки различались у разных людей в зависимости от характера их заболевания.Клиническое состояние пациентов настолько отличалось от группы здоровых добровольцев, что исследователя невозможно было скрыть, к какой группе принадлежали люди. Тем не менее, использование метода отбора проб, который удалял зубной налет вокруг краев десны и на глубину здоровой щели как в группах с экспериментальным гингивитом, так и в группах с пародонтитом, стандартизировал физическую среду, из которой были взяты поверхностные образцы зубного налета. Поверхностный зубной налет здоровых добровольцев и пациентов с пародонтитом использовали для межгруппового сравнения, а также проводили дополнительное сравнение между поверхностными и поддесневыми образцами у пациентов.

Экстракция ДНК

экстрагировали из образцов с использованием набора для выделения бактериальной ДНК GenElute (Sigma-Aldrich). Экстракции проводили в соответствии с инструкциями производителя с дополнительной стадией лизиса для увеличения извлечения ДНК грамположительных бактерий: образцы инкубировали с раствором лизоцима 45 мг/мл при 37°С в течение 30 минут. Было показано, что этот протокол эффективен для выделения ДНК из фиктивных сообществ, состоящих из смеси грамположительных и грамотрицательных видов бактерий полости рта (неопубликованные данные).Экстрагированную ДНК хранили при температуре -70°C до дальнейшей обработки.

ПЦР гена 16S рРНК и 454 пиросеквенирование

Область гена 16S рРНК длиной примерно 500 п.н. (охватывающая V1–V3) была амплифицирована методом ПЦР из выделенных образцов ДНК с использованием составных слитых праймеров, включающих универсальные праймеры 16S (27FYM [26] и 519R [27]) вместе с Roche GS — Адаптерные последовательности FLX Titanium Series (A и B) для пиросеквенирования 454 с использованием метода Lib-L emPCR. Описанные ранее уникальные 12-основные последовательности штрих-кода Голея с исправлением ошибок [28] были включены в прямые праймеры (5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-NNNNNNNNNNNN-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′), чтобы обеспечить объединение образцов в одном цикле секвенирования.Соответствующие праймеры A-27FYM и B-519R (5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-GWATTACCGCGGCKGCTG-3′) со штрих-кодом использовали в ПЦР с Extensor Hi-Fidelity PCR Mastermix (Thermo Scientific). Был начальный этап денатурации в течение 5 минут при 95°С, за которым следовали 25 циклов 95°С в течение 45 с, 53°С в течение 45 с, 72°С в течение 1 м 30 с и конечное удлинение при 72°С в течение 15 с. мин. Ампликоны ПЦР впоследствии очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Размер и чистоту ампликонов проверяли с использованием набора Agilent DNA 1000 и биоанализатора Agilent 2100.Ампликоны количественно определяли с помощью флуорометрического анализа с использованием красителя флуоресцентной нуклеиновой кислоты Quant-iT Picogreen (Invitrogen) и затем объединяли в эквимолярных концентрациях (1×10 ⁹ молекул/мкл). эмПЦР и ненаправленное секвенирование библиотек проводили с использованием набора Lib-L и секвенатора Roche 454 GS-FLX Titanium Центром гематоонкологии, Института рака Бартса, Лондонский университет королевы Марии, Лондон, Великобритания.

Анализ последовательности

Предварительную обработку и анализ последовательностей проводили с помощью пакета анализа mothur v 1.26.0 [29] на основе стандартной операционной процедуры (СОП) Шлосса [30]. Сначала последовательности были очищены от шума с использованием алгоритма AmpliconNoise [31], реализованного mothur. После шумоподавления любые последовательности длиной менее 350 п.н. и/или имеющие один из следующих признаков: >2 несоответствия в праймере, >1 несоответствие в областях штрих-кода и гомополимеры >8 оснований, были удалены из набора данных. Остальные последовательности были обрезаны для удаления праймеров и штрих-кодов и сопоставлены с эталонным выравниванием SILVA 16S рРНК [32].Алгоритм UChime [33] использовали для идентификации и удаления химерных последовательностей. Последовательности идентифицировали с помощью BLAST по базе данных микробиома ротовой полости человека (HOMD) [34] при ≥98,5% идентичности последовательностей. Кроме того, последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTU) на расстоянии несходства последовательностей 0,015 с использованием алгоритма среднего соседства, а затем классифицированы с использованием наивного байесовского классификатора с эталонным набором данных HOMD v 10.1. Там, где это необходимо, были даны возможные альтернативы идентификации видов.Ранее описанный метод был использован для отличия комменсальных стрептококков группы mitis от близкородственного патогена Streptococcus pneumoniae [35]. Непараметрическая оценка охвата Гуда [36] использовалась для оценки объема выборки сообществ. Разнообразие сообществ рассчитывали с помощью обратного индекса разнообразия Симпсона [37], а общее богатство сообществ оценивали с помощью Chao1[38] и CatchAll [39]. Индекс Жаккара и метрика thetaYC [40] использовались для создания матриц расстояний из библиотек субвыборок последовательностей (равных матрицам библиотек с наименьшим количеством последовательностей), которые визуализировались в виде дендрограмм и графиков PCoA (анализ основных координат).Трехмерные графики PCoA были созданы в R (r-project.org) с использованием пакета rgl. Также было проведено сравнение β-разнообразия сообществ на основе их филогенетического родства. Для этого было проанализировано соседнее дерево последовательностей, построенное с помощью Clearcut [41], с помощью невзвешенных и взвешенных показателей UniFrac [42], реализованных mothur и визуализированных, как указано выше.

Статистический анализ

Непараметрические ранговые критерии Фридмана и Уилкоксона использовались для проверки значимости различий в богатстве OTU и разнообразии образцов из разных временных точек экспериментального гингивита.Поправку Бонферрони для множественных сравнений применяли к значению альфа для попарных сравнений. Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) [43] был выполнен в mothur, чтобы определить, подтверждаются ли статистически модели кластеризации, наблюдаемые на графиках PCoA, различиями в матрицах расстояний. Поправку Бонферрони для множественных сравнений применяли к значению альфа при сравнении временных точек экспериментального гингивита. Parsimony [44], реализованный mothur, использовался для определения значимости кластеризации в дендрограммах.Ассоциации OTU с временными точками экспериментального гингивита и баллами BoP были обнаружены с использованием многомерной ассоциации с линейными моделями (MaAsLin) [45]. Размер эффекта линейного дискриминантного анализа (LEfSe) [46] был использован для выявления существенных различий в относительном количестве OTU между здоровыми и хроническими когортами периодонтита. Значения альфа в LEfSe были установлены на 0,05, и был применен порог LDA 2,0. Двухвыборочные тесты t и парные t -тесты были выполнены в R, чтобы определить, были ли статистически значимыми различия в относительном содержании типов между здоровой и пародонтитной когортой и между временными точками экспериментального гингивита.К значениям альфа применяли поправку Бонферрони для множественных сравнений. Оценки дихотомических бляшек и кровотечений выражали в процентах от числа оцениваемых участков. Показатели процентного содержания зубного налета сначала анализировали с использованием критерия Фридмана для непараметрических данных, чтобы установить, существовала ли статистически значимая разница в количестве зубного налета в трех временных точках, а затем проводили сравнение между временными точками с использованием ранговых критериев Уилкоксона. Поскольку процентные показатели кровотечения измерялись только в двух временных точках, их анализировали с использованием рангового критерия Уилкоксона.Объем GCF был непрерывной, нормально распределенной переменной и поэтому сначала анализировался с использованием дисперсионного анализа с повторными измерениями, а затем сравнивался между отдельными временными точками, оцениваемыми с использованием парных t-тестов.

Культуральный анализ

Для десяти здоровых субъектов базовые и двухнедельные образцы зубного налета культивировали на неселективной среде: сначала 500 мкл суспензии 0,1x TE, содержащей зубной налет, обрабатывали ультразвуком в течение 20 с. Десятикратные серийные разведения обработанных ультразвуком образцов (до 10 ⁵ ) были сделаны в предварительно разбавленной транспортной среде и высеяны на основу кровяного агара №.2+5% об./об. лошадиной крови (BA) и привередливого анаэробного агара +5% об./об. лошадиной крови (FAA) в трех повторностях. Планшеты с БА инкубировали в течение 4 дней в среде 5% C0 ₂ + воздух при 37°C, тогда как планшеты с FAA инкубировали в течение 10 дней в анаэробном шкафу с атмосферой 80% N ₂ , 10% H ₂ и 10% С0 ₂ при 37°С. После инкубации чашки подсчитывали и случайным образом пересевают 96 колоний (48 из BA и 48 из FAA) [47]. Изоляты идентифицировали с помощью анализа последовательности гена 16S рРНК [48] и анализировали с помощью mothur, как описано выше.

Исследование потенциально новых оральных таксонов

Филотипы, которые не соответствовали таксонам в HOMD (<98,5% идентичности последовательности) и присутствовали по крайней мере у двух человек, были исследованы дополнительно. Конкретные прямые праймеры были сконструированы из 454 последовательностей и использованы для амплификации гена 16S рРНК целевого филотипа в сочетании с праймером 1492R. Ампликоны ПЦР нужного размера впоследствии клонировали в Escherichia. coli с использованием набора для клонирования TOPO (Invitrogen, UK) и секвенировали, как описано ранее [48].

Результаты

Клинические результаты

Экспериментальная группа пациентов с гингивитом состояла из 16 женщин и четырех мужчин со средним возрастом 28,1 (± 2,1). 19 испытуемых завершили исследование. Один субъект выбыл из исследования из-за инфекции грудной клетки. О других побочных эффектах или осложнениях не сообщалось. Через две недели у всех испытуемых образовался толстый отчетливо видимый налет на большинстве поверхностей зубов. У них было значительно повышенное кровоточивость десен по шкале зондирования (BoP) (таблица 1), а средний объем жидкости десневой борозды (GCF) значительно увеличился через одну и две недели.Всего было отобрано 11 женщин и 9 мужчин с хроническим пародонтитом, средний возраст которых составил 48,5 (± 9) лет. Двухвыборочный тест t показал, что пациенты с пародонтитом были значительно старше, чем экспериментальная группа с гингивитом. Среднее количество зубов на пациента составило 28,1 (±2,8), в то время как количество зубов на пациента с глубиной кармана ≥6 мм составило 11,9 (±5,9). У 14 пациентов были получены образцы поддесневого налета из глубоких карманов в качестве дополнительного сравнения с образцами налета вокруг края десны.

Краткий обзор пиросеквенирования

394 558 последовательностей со средней длиной 423 основания были получены после начальной фильтрации качества. Сопоставление со справочной базой данных SILVA, последующий скрининг выравнивания и удаление химер привели к окончательному набору данных из 344 267 высококачественных последовательностей (из которых 31 604 были уникальными) со средней длиной 354 основания. Это обеспечило окончательный средний выход 3742 (± 789) последовательностей на образец для дальнейшего анализа.

Альфа- и бета-разнообразие бактериальных сообществ зубного налета на основе OTU

Кластеризация последовательностей в OTU на расстоянии 0.015 привело к появлению от 89 до 394 (в среднем 299) OTU видового уровня на образец зубного налета/бактериальное сообщество. Средний охват сообществ по непараметрическому методу Гуда составил 96,9% (±0,7%). Оценки Chao1 общего богатства OTU варьировались от 130 до 634 OTU (медиана 464), в то время как CatchAll дал оценки от 200 до 1690 (медиана 644). Наблюдаемое богатство OTU и разнообразие сообществ (обратный индекс разнообразия Симпсона) в разное время выборки экспериментального гингивита показаны на рисунке 2. Богатство сообществ в разные моменты времени значительно различалось (критерий Фридмана, P <0.016). Используя попарные тесты Уилкоксона со знаком ранга, не было обнаружено существенной разницы между исходными сообществами и одно- и двухнедельными сообществами. Однако количество OTU было значительно выше в двухнедельных сообществах по сравнению с однонедельными сообществами ( P <0,01). Наблюдалась значительная разница в разнообразии во времени (критерий Фридмана, P <0,00044). Попарные ранговые критерии Уилкоксона показали, что разнообразие было значительно выше в двухнедельных сообществах по сравнению с исходным уровнем ( P <0.0001) и однонедельные сообщества ( P <0,0012), но не было существенной разницы между исходным уровнем и однонедельными сообществами. Таблица, обобщающая параметры альфа-разнообразия для каждого из 92 проанализированных образцов, показана во вспомогательной информации (таблица S1). Всего восемь OTU, отнесенных к таксонам: Actinobaculum sp. HOT183, Campylobacter gracilis, Campylobacter showae, Cardiobacterium hominis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Lautropia mirabilis, Streptococcus mitis /HOT064/HOT423/HOTA95/HOTE14 и Veillonella parvula, были обнаружены во всех исходных образцах здоровых субъектов.Три OTU, отнесенные к таксонам Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, и Streptococcus mitis /HOT064/HOT423/HOTA95/HOTE14 были общими для всех пациентов с пародонтитом.

Рисунок 2. Богатство и разнообразие зубного налета во время индукции экспериментального гингивита.

Графики типа «ящик с усами», сравнивающие богатство OTU на уровне видов и разнообразие временных точек во время экспериментального гингивита.Верхняя и нижняя границы прямоугольников показывают 75 90 537 th 90 538 и 25 90 537 th 90 538 процентилей, а концы усов показывают максимальное и минимальное значения. Жирные линии внутри прямоугольников представляют средние значения (50 90 537 th 90 538 процентилей). ( A ) Количество наблюдаемых OTU на исходном уровне (B), через одну неделю (W1) и через две недели (W2). ( B ) Обратный индекс разнообразия Симпсона на исходном уровне (B), через одну неделю (W1) и через две недели (W2).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.g002

Сравнение состава бактериального сообщества (индекс Жаккара и невзвешенный UniFrac) образцов зубного налета с использованием дендрограмм показало, что сообщества из разных временных точек экспериментального гингивита сгруппированы в основном по субъектам (рис. S1). Отдельное сравнение исходных бляшек от здоровой когорты до поверхностных бляшек у пациентов с хроническим пародонтитом показало некоторую группировку по когортам (рис. S2). Интересно, что отдельный анализ образцов поверхностного и поддесневого зубного налета у пациентов с пародонтитом показал, что сообщества сгруппированы по пациенту, а не по типу образца зубного налета (рис. S3).Для каждой дендрограммы был проведен экономный анализ, чтобы оценить значимость моделей кластеризации групп и временных точек. Наблюдалась значительная разница между кластеризацией исходных сообществ здоровых субъектов и сообществ поверхностных бляшек пациентов с пародонтитом ( P <0,036 и P <0,012 для индекса Жаккара и невзвешенных дендрограмм UniFrac, соответственно). Не было никаких существенных различий между кластеризацией сообществ из разных временных точек экспериментального гингивита или между поверхностными и поддесневыми сообществами зубного налета у пациентов с пародонтитом.

Сравнение структуры бактериального сообщества образцов зубного налета было выполнено с использованием показателей thetaYC и взвешенных показателей UniFrac, на основе которых были построены матрицы расстояний и визуализированы с помощью PCoA (рис. 3 и 4). Для экспериментальной когорты гингивита оба графика показали пространственное разделение одно- и двухнедельных сообществ от исходных сообществ (рис. 3). Кроме того, отдельные анализы PCoA, сравнивающие сообщества поверхностного пародонтита со здоровыми исходными сообществами (рис. 4) и сообществами двухнедельного гингивита (не показаны), показали разделение в каждом случае.Тесты AMOVA выявили общую значительную разницу между тремя временными точками экспериментального гингивита как для тетаYC, так и для взвешенных расстояний UniFrac ( P <0,0016 и P <0,001 соответственно). Попарные сравнения AMOVA показали, что существуют значительные различия между базовыми и однонедельными сообществами ( P <0,017 и P <0,001 для thetaYC и взвешенного UniFrac соответственно) и между исходными и двухнедельными сообществами ( P <0 .0006 и P <0,001 для тетаYC и взвешенного UniFrac соответственно). Однако не было существенной разницы между одно- и двухнедельными сообществами ( P  = 0,526 и P  = 0,098 для thetaYC и взвешенного UniFrac соответственно). Тесты AMOVA также подтвердили, что существуют значительные различия между исходными сообществами здоровых субъектов и поверхностными сообществами пациентов с пародонтитом ( P  = 0,0095 и P <0,001 для thetaYC и взвешенного UniFrac соответственно).Точно так же была значительная разница между двухнедельными сообществами и образцами поверхностного пародонтита ( P <0,0005 как для thetaYC, так и для взвешенного UniFrac). Не было существенной разницы в расстояниях thetaYC или взвешенных UniFrac между образцами поверхностного и поддесневого периодонтита у пациентов с пародонтитом при тестировании AMOVA.

Рисунок 3. Сдвиги в структуре бактериального сообщества зубного налета во время индукции экспериментального гингивита.

Графики PCoA, сравнивающие структуру сообщества образцов зубного налета из разных моментов времени экспериментального гингивита. Базовые образцы окрашены в зеленый цвет, образцы за одну неделю — в оранжевый, а образцы за две недели — в красный. ( A ) PCoA на основе калькулятора thetaYC. PC1 = 12,11% объясненной дисперсии, PC2 = 8,89%, PC3 = 5,55% ( B ) PCoA на основе взвешенного калькулятора UniFrac. ПК1 = 19,78% объясненной дисперсии, ПК2 = 10,65%, ПК3 = 5,65%.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0071227.g003

Рисунок 4. Структура бактериального сообщества зубного налета в норме и при хроническом пародонтите.

Графики PCoA, сравнивающие структуру сообщества исходных образцов зубного налета из когорты здоровых людей с образцами наддесневого зубного налета у пациентов с хроническим пародонтитом. Сообщества зубного налета у здоровых людей окрашены в зеленый цвет, а при пародонтите — в фиолетовый. ( A ) PCoA на основе калькулятора thetaYC, PC1 = 16,38% объясненной дисперсии, PC2 = 10.09%, PC3 = 8,02% ( B ) PCoA на основе взвешенного калькулятора UniFrac, PC1 = 22,12% объясненной дисперсии, PC2 = 8,89%, PC3 = 6,85%.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.g004

Состав и сдвиги бактериальных сообществ на уровне OTU

10 OTU, обнаруженных с самой высокой относительной численностью во всех 92 образцах, были отнесены к таксонам Streptococcus sanguinis, Rothia dentocariosa, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Streptococcus mitis / HOT064/ HOT423/ HOTA95/ HOTE14, Streptococcus cristatus / HOT071, Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, Lautropia mirabilis, Porphyromonas gingivalis и Leptotrichia buccalis. Относительная численность первых 50 обнаруженных OTU в пределах выборки показана во вспомогательной информации (набор данных S1). Статистический анализ с использованием линейных моделей, реализованных в MaAsLin, первоначально был выполнен для определения корреляций OTU со временем выборки во время экспериментального гингивита.Полный список полученных OTU, которые положительно или отрицательно коррелировали с периодами экспериментального гингивита в течение одной и/или двух недель, показан в таблице S2. Коробчатые диаграммы, показывающие изменения относительной численности с течением времени для наиболее значимых OTU, показаны на рисунке S4. Второй анализ в MaAsLin включал показатели кровотечения при зондировании (BoP), а также исходные и двухнедельные временные точки. OTU были статистически связаны с клиническим состоянием, определяемым баллами BoP, а не с моментом времени, когда были собраны образцы.OTU, идентифицированные как Lautropia sp. HOTA94, Lachnospiraceae sp. HOT100, Prevotella oulorum и Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum наиболее значимо положительно коррелировал с ПБ (значения P и Q <0,05), в то время как OTU, идентифицированная как Rothia dentocariosa , наиболее значимо отрицательно коррелировала с ПБ. Полный список OTU, которые коррелировали с показателями BoP, показан в таблице S3.Линейный дискриминантный анализ с использованием LEfSe был использован для обнаружения OTU, относительное содержание которых значительно различалось между хроническим пародонтитом (поверхностный налет) и здоровым (базовый налет). Было обнаружено, что в общей сложности 41 OTU значительно различаются между этими группами (рис. 5). OTU, идентифицированный как Porphyromonas gingivalis , наиболее тесно связан с хроническим пародонтитом.

Рис. 5. Обнаружение различных OTU в норме и при хроническом пародонтите.

Различное количество OTU между исходными сообществами зубного налета экспериментальной когорты гингивита и сообществами поверхностного зубного налета у пациентов с хроническим пародонтитом по данным LEfSe. OTU ранжируются по величине эффекта LDA. OTU, связанные со здоровыми субъектами, показаны зеленым цветом, а OTU, связанные с хроническим пародонтитом, показаны красным.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.g005

Идентификация BLAST с использованием эталонного набора HOMD

Сводка ВЗРЫВА.

После BLAST 331 398 из 344 267 последовательностей (96,3%) были сопоставлены с таксонами в эталонном наборе HOMD. 331 398 последовательностей были отнесены к 11 типам, 126 родам и 567 филотипам/группам на уровне видов. 3,7% из 344 267 последовательностей не были отнесены (<98,5%) к какому-либо известному филотипу в эталонном наборе HOMD.

Phylum.

Преобладающими типами, обнаруженными во всех образцах налета в порядке средней относительной численности в образцах, были Firmicutes (31.3%), Fusobacteria (19,0%), Bacteroidetes (18,9%), Actinobacteria (14,0%) и Proteobacteria (13,9%). Другие обнаруженные филюмы, но которые не присутствовали в каждом образце, включали TM7, Synergistetes , Spirochaetes , SR1, Chloroflexi и GN02. Существовала значительная индивидуальная вариабельность относительного обилия типов как среди здоровых людей, так и среди пациентов с хроническим пародонтитом. Однако сравнение средней относительной численности преобладающих типов для каждой когорты (рисунок S5) показало, что протеобактерий были значительно более распространены в здоровом состоянии (два образца t — тест: P <0.0056), в то время как Bacteroidetes были значительно более распространены при пародонтите ( P <0,0039). Кроме того, типы Synergistetes и Spirochaetes были обнаружены у 90% и 95% пациентов с пародонтитом и у 40% и 80% здоровых субъектов соответственно. Тип Chloroflexi не был обнаружен у здоровых людей, но был обнаружен у 15% пациентов с пародонтитом в низких концентрациях. Сдвиги на уровне типа внутри и между всеми субъектами наблюдались во время экспериментального гингивита (рис. S6).В частности, относительная численность Actinobacteria была значительно выше на исходном уровне по сравнению с одной и двумя неделями (парный тест t : P < 0,001 для обоих сравнений), в то время как Bacteroidetes была значительно выше в одно- и двухнедельный период. двухнедельные образцы по сравнению с исходным уровнем ( P <0,001 для обоих сравнений). Однако сдвиги в типах во время экспериментального гингивита показали значительную изменчивость среди людей. Например, четвертый субъект показал резкое снижение относительной численности Actinobacteria с 41.от 6% в начале до 9,3% через две недели. Напротив, относительная численность Actinobacteria у пятого субъекта составляла 15,1% в начале исследования и 18,5% через две недели.

Анализ сообщества на основе культуры

исходных и двухнедельных образцов зубного налета были культивированы у 11 здоровых субъектов. Для одного субъекта была получена только исходная выборка (второй субъект). 1935 из 1956 изолятов были отнесены к таксонам в расширенном эталонном наборе HOMD V1.1 с использованием BLAST (идентичность последовательностей ≥98,5%).Эти последовательности представляли пять типов ( Actinobacteria , Bacteroidetes , Firmicutes , Fusobacteria и Proteobacteria ) и 43 рода. Филотипы/группы, обнаруженные с наивысшей относительной численностью при использовании обеих инкубаций (анаэробной и воздушной +5% C0 ₂ ), включали Streptococcus sanguinis и группу Actinomyces naeslundii . S. sanguinis был наиболее распространенным изолятом на исходном уровне со средней относительной численностью 18.8% и 13,8% с использованием воздуха +5% C0 ₂ и анаэробной инкубации соответственно. Через две недели группа A. naeslundii была самой многочисленной (21,7% и 14,0% при использовании воздуха +5% C0 ₂ и анаэробной инкубации соответственно). Наблюдаемое богатство и разнообразие OTU исходных и двухнедельных сообществ по культурам обобщено в таблице 2.

Ряд таксонов, выделенных в культуре, не были обнаружены пиросеквенированием среди одних и тех же образцов, в том числе Actinomyces sp.HOT172, Capnocytophaga sp. HOT380, группа Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis , Staphylococcus warneri, Paenibacillus HOTA06 и Propionibacterium acnes /HOT193. Культурой не были обнаружены представители филы GN02, Spirochaetes , SR1, Synergistetes или TM7.

Новые оральные таксоны

12 869 последовательностей в наборе данных пиросеквенирования не были сопоставлены ни с одним таксоном в HOMD (<98.5% сходства последовательностей). Эти последовательности представляли линии внутри ряда различных типов, и многие из них были обнаружены в нескольких образцах как в экспериментальных когортах гингивита, так и в когортах хронического периодонтита. Семь из этих филотипов/групп были исследованы дополнительно. Практически полноразмерные последовательности были получены для всех этих филотипов/групп с использованием специфических праймеров 16 S рРНК для направленной ПЦР, а также для двух новых культивируемых изолятов, которые были доступны в GenBank и отправлены в HOMD. Сводная информация об этих таксонах, их ближайших известных филогенетических родственниках и инвентарных номерах Genbank представлена ​​в таблице 3.Особый интерес представляла глубокая ветвящаяся линия внутри класса Mollicutes , представляющая новый отряд. Распространенность этих таксонов в когортах пациентов с экспериментальным гингивитом и хроническим пародонтитом показана в таблице S4, а филогенетические деревья для каждого таксона показаны на рисунках S7–15.

Обсуждение

Это первое исследование с использованием 454-пиросеквенирования для изучения бактериального состава зубного налета при экспериментальном гингивите и одно из немногих опубликованных продольных исследований микробиома полости рта.Результаты этого исследования показали, что при отсутствии гигиены полости рта переход от здоровья пародонта к гингивиту сопровождается сдвигом в структуре бактериального сообщества зубного налета и увеличением разнообразия бактериального сообщества. Кроме того, результаты продемонстрировали значительные различия как в составе, так и в структуре аналогичных образцов бляшек, связанных со здоровьем и хроническим пародонтитом, и подтвердили связь определенных видов, ранее связанных с хроническим пародонтитом [18], [19].

Ряд предыдущих высокопроизводительных исследований секвенирования 16S рРНК охарактеризовали бактериальные сообщества полости рта только на уровне типа или рода [49]–[51]. Важно различать таксоны на видовом уровне, поскольку разные виды в пределах одного и того же типа и/или рода могут быть связаны со здоровьем или с патогенами/болезнями. Нацеливание на высоковариабельную область гена 16S рРНК (V1-V3) и использование курируемого референсного набора генов 16S рРНК человека (HOMD) позволило идентифицировать OTU (кластеризованные на расстоянии 0.015) до видового уровня, где это возможно. В то время как в некоторых исследованиях [18]–[20] также недавно сообщалось о пиросеквенировании гена 16S рРНК на уровне видов бактериальных сообществ при здоровье пародонта, гингивите и хроническом пародонтите, эти исследования носили перекрестный характер и не изучали изменения в одних и тех же людей при переходе от здоровья к болезни. В настоящем исследовании в раннем зубном налете, ассоциированном со здоровьем, было выявлено богатое видами бактериальное сообщество (201–383 OTU на образец).Это богатство значительно выше, чем указано в культуральных данных этого исследования (таблица 2) и в предыдущих исследованиях, характеризующих микробиом полости рта в здоровом состоянии. Аас и др. [13] обнаружили от 12 до 27 видовых филотипов на поверхности зубов и от 4 до 21 в поддесневом налете, в то время как Bik et al. [15] обнаружили от 65 до 128 OTU на уровне видов в объединенных образцах с разных поверхностей полости рта. Количество OTU на уровне вида на образец зубного налета, наблюдаемое у здоровых людей в настоящем исследовании, находится в том же диапазоне, что и в других недавних исследованиях пиросеквенирования 16S рРНК.Заура и др. [52] обнаружили в среднем 266 филотипов на уровне видов (сходство последовательностей 97%) на образец, а Griffen et al. [18] обнаружили от 100 до 300 филотипов (сходство последовательностей 98%) на человека. Однако Хуанг и соавт. [20] сообщили о наличии 379–684 OTU видового уровня (сходство последовательностей 97%) в наддесневом налете здоровых людей. Однако сравнение количества наблюдаемых OTU или филотипов между этим и другими исследованиями осложняется различными методологиями, такими как, помимо прочего, использование разных областей гена 16S рРНК и различных пределов сходства последовательностей для Кластеризация OTU или классификация BLAST.Недавнее исследование [22] проанализировало имитацию бактериального сообщества с помощью пиросеквенирования и показало, что, несмотря на шумоподавление и строгую качественную фильтрацию, были обнаружены дополнительные ошибочные OTU, что указывает на то, что пиросеквенирование может по-прежнему переоценивать количество присутствующих OTU.

Богатство OTU на уровне видов, обнаруженное с помощью пиросеквенирования, не было значительно выше у субъектов после одной и двух недель без гигиены полости рта. Возможно, это было неожиданно, учитывая противоположные результаты предыдущего экспериментального исследования гингивита на основе культуры [9].Однако эти наблюдения аналогичны наблюдениям Huang et al. [20], которые с помощью пиросеквенирования не отметили существенной разницы в насыщенности образцов налета у здоровых людей и у людей с гингивитом. Значительное увеличение разнообразия сообщества (обратный индекс разнообразия Симпсона) после двух недель экспериментального гингивита при отсутствии значительного увеличения разнообразия указывало на то, что увеличение разнообразия было в основном результатом увеличения однородности. Это говорит о том, что по мере накопления налета виды, которые доминировали в ранних сообществах по состоянию здоровья, со временем уменьшались в относительной численности, в то время как относительная численность ранее второстепенных видов увеличивалась, что приводило к более равномерному распределению видов после двух недель накопления налета.Данные пиросеквенирования показали значительные различия между структурами бактериального сообщества (с использованием как OTU-, так и филогенетического анализа) зубного налета в норме (исходный уровень) и гингивита (образцы зубного налета через одну и две недели). Однако сравнение кластеров на основе членства в сообществе показало, что межиндивидуальные различия были больше. Это было подтверждено небольшим количеством OTU, которые были общими для всех 20 здоровых субъектов, что свидетельствует о небольшой основной / общей микробиоте полости рта в зубном налете на этом таксономическом уровне.

Графики PCoA выявили сдвиг в структуре бактериального сообщества по мере развития гингивита у субъектов после отмены гигиены полости рта. Однако интересно отметить, что графики PCoA также показали значительную изменчивость в структуре сообщества среди здоровых субъектов. Эта изменчивость была очевидна как на уровне типа, так и на уровне вида. Например, относительная численность Actinobacteria колебалась от 8,4% до 55,9% в исходных образцах. На видовом уровне OTU, которые доминировали в исходных выборках некоторых особей, были обнаружены только при низкой относительной численности или вообще не были обнаружены в других.OTU, идентифицированная как Neisseria flavescens / subflava , была доминирующей OTU на исходном уровне у 16 ​​субъектов (8,81% последовательностей), но не была обнаружена у 11 здоровых субъектов. Было бы полезно, если бы будущие исследования по изучению микробного состава зубного налета в норме и при заболеваниях пародонта включали большее число субъектов, поскольку относительно небольшое количество (20 здоровых субъектов и 20 пациентов с хроническим пародонтитом) в настоящем исследовании было ограничением, учитывая наблюдаемое межиндивидуальная изменчивость.Этому может способствовать дальнейшее развитие технологий высокопроизводительного секвенирования. Несмотря на эту межиндивидуальную вариабельность, в настоящем исследовании был выявлен ряд OTU, которые показали значительные изменения в относительной распространенности через одну и две недели экспериментального гингивита. Анализы также выявили OTU, которые отрицательно или положительно коррелировали с показателями кровотечения при зондировании (BoP). OTU, относительная численность которых со временем уменьшалась и которые отрицательно коррелировали с BoP, представляли собой преимущественно аэробные и факультативно анаэробные грамположительные кокки и палочки, включая представителей родов Actinomyces , Rothia и Streptococcus .Ранее было показано, что Streptococcus spp., Actinomyces spp. и Rothia spp. являются одними из первых колонизаторов поверхности зубов [21], [53] и преобладают во рту здоровых людей [13], [15], поэтому неудивительно, что представители этих родов были в изобилии здоровыми. OTU, идентифицированный как Rothia dentocariosa , показал наиболее значимую отрицательную корреляцию с экспериментальным гингивитом через одну и две недели и с повышенными показателями BoP. R. dentocariosa ранее идентифицировали как обычный компонент микробиома полости рта в норме, особенно на поверхности зубов [13], [15], [50], а род Rothia был связан со здоровьем полости рта. [18], [54]. Кроме того, недавнее исследование пиросеквенирования показало, что R. dentocariosa доминирует в проанализированных сообществах поддесневого зубного налета, связанных со здоровьем [19]. OTU, относительная численность которых увеличивалась по мере развития гингивита и которые положительно коррелировали с показателями BoP, были в основном грамотрицательными таксонами родов Campylobacter , Fusobacterium , Lautropia, Leptotrichia, Porphyromonas, Selenomonas, и Tannerella. Среди тех, что культивировались ранее, многие были облигатными анаэробами. Эти результаты в значительной степени согласуются с наблюдениями Theilade et al. [7], которые в раннем экспериментальном исследовании гингивита сообщили об увеличении доли грамотрицательных кокков и палочек, а также нитей, спирилл и спирохет по мере развития гингивита. OTU, наиболее сильно положительно коррелировавшие с повышенными показателями BoP, включали безымянные филотипы Lachnospiraceae [G-2] sp.HOT100 и Lautropia sp. HOTA94, а также названные ранее культивируемые организмы Fusobacterium nucleatum subsp. полиморфный и Prevotella oulorum. Интересным наблюдением этого исследования было увеличение относительной численности в одно- и двухнедельные моменты времени и положительная корреляция с BoP OTU, идентифицированного как Tannerella sp. HOT286 (также известный как оральный клон BU063). Этот филотип, близкий родственник предполагаемого патогена пародонта Tannerella forsythia , ранее был связан со здоровьем пародонта в исследовании с использованием ПЦР для сравнения его распространенности у 25% населения с наиболее тяжелым пародонтитом с его распространенностью у 25% населения. населения с лучшим пародонтальным здоровьем [55].В этом исследовании относительно здоровые субъекты включали некоторых с глубиной кармана и потерей прикрепления максимум до 5 мм, и, в отличие от настоящего исследования, степень воспаления десны не сообщалась. [55]. Интересно, что Tannerella sp. в другом исследовании с использованием флуоресцентной гибридизации in situ было обнаружено, что оральный клон BU063 более распространен среди людей с гингивитом и язвенно-некротическим гингивитом, чем у людей с пародонтитом [56]. Кроме того, Huang et al.[20] недавно сообщили о значительно более высокой относительной численности Tannerella sp. BU063 в зубном налете у людей с гингивитом, чем у здоровых людей.

Большинство OTU, которые имели значительно более высокую относительную распространенность у пациентов с хроническим пародонтитом, чем у здоровых людей, были таксонами, которые ранее были связаны с пародонтитом. Однако один тесно связанный OTU ( Leptotrichia sp. HOTB57) может представлять собой дополнительный таксон, который можно добавить в этот расширяющийся список. Porphyromonas gingivalis обладал наибольшим размером эффекта среди ассоциированных OTU и ранее ассоциировался с периодонтитом на основании как зависимых от культуры, так и независимых исследований [14], [16], [57]. Интересно, что Prevotella denticola был среди других OTU, сильно связанных с периодонтитом. Ранее было обнаружено, что P. denticola увеличивает заболеваемость с увеличением тяжести заболевания пародонта на основе посева [58], была обнаружена с более высокой распространенностью у пациентов с пародонтитом, чем у здоровых людей, с помощью видоспецифичной ПЦР [16] и была тесно связана с хроническим периодонтит в другом недавнем исследовании пиросеквенирования [18]

Добровольная группа здоровых испытуемых состояла из всего клинического персонала Стоматологического института, который был высоко мотивирован и хорошо информирован в практике эффективной гигиены полости рта.Клиническое состояние при тяжелом хроническом пародонтите создавало существенно разные клинические условия для сравнения, но нельзя сказать, что удобная выборка из 20 пациентов с тяжелым хроническим пародонтитом представляет всю популяцию с пародонтитом. Пациенты с пародонтитом были значительно старше здоровых добровольцев, и это ограничение настоящего исследования. По этическим причинам было бы нецелесообразно отслеживать изменения в микробиоте, позволяя необратимому деструктивному заболеванию прогрессировать в течение нескольких лет без вмешательства.Влияние возраста пациента на микробиоту нельзя легко отделить от влияния различной микробной среды обитания, которая развивается по мере старения пациента и прогрессирования заболевания. Это исследование не могло быть этически разработано для мониторинга микробиоты по мере того, как гингивит прогрессировал до пародонтита или по мере того, как пародонтит усугублялся с возрастом. Потребуются более обширные исследования для сравнения различных типов заболеваний пародонта, различных уровней заболевания в разных возрастных группах и популяциях, прежде чем можно будет с полной уверенностью описать действительно всестороннее описание микробиома пародонта.Тем не менее, в пределах этих ограничений, в текущей работе успешно применена технология глубокого секвенирования для мониторинга краткосрочных изменений микробиоты во время индукции обратимого легкого пародонтита и сопоставления ее с микробиотой группы пациентов с тяжелым и необратимым пародонтитом.

В заключение, это исследование показало наличие очень богатой бактериальной биоты в зубном налете, связанном со здоровьем, и определило продольные сдвиги в структуре бактериального сообщества по мере накопления зубного налета и развития гингивита.Анализ выявил новые таксоны, связанные со здоровьем и гингивитом, и подтвердил связь ряда предполагаемых пародонтологических патогенов с хроническим пародонтитом. Дальнейшее изучение этих таксонов может привести к разработке новых методов лечения, направленных на предотвращение ранних стадий заболеваний пародонта.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Скопление сообществ зубного налета при экспериментальном гингивите. Дендрограмма образцов зубного налета из всех временных точек экспериментального гингивита в сравнении на основе их принадлежности к сообществу с использованием индекса Жаккара.HS = здоровый субъект, B = исходный уровень, 1W = одна неделя, 2W = две недели. Цифры обозначают номер темы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s001

(PDF)

Рисунок S2.

Скопление сообществ зубного налета в норме и при хроническом пародонтите. Дендрограмма образцов зубного налета из исходной точки времени экспериментальной группы пациентов с гингивитом и поверхностных образцов зубного налета у пациентов с пародонтитом, сравниваемых на основе их принадлежности к сообществу с использованием индекса Жаккара.HS = здоровый субъект, B = исходный уровень, CP = пациенты с хроническим пародонтитом. Цифры обозначают номер субъекта или пациента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s002

(PDF)

Рисунок S3.

Скопление поверхностных и поддесневых бляшек при хроническом пародонтите. Дендрограмма образцов поверхностного и поддесневого зубного налета у пациентов с хроническим пародонтитом в сравнении на основе их принадлежности к сообществу с использованием индекса Жаккара.CP = пациенты с хроническим пародонтитом, Sub = поддесневой зубной налет. Цифры обозначают номер пациента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s003

(PDF)

Рисунок S4.

Изменения относительной численности OTU при индукции экспериментального гингивита. Коробчатые диаграммы, показывающие значительные изменения в относительном количестве OTU во время индукции экспериментального гингивита. Время 1  =  базовый уровень, Время 2  = 1 неделя, Время 3  = 2 недели. Все показанные OTU: P <0.05, О <0,05. В скобках указаны коэффициенты корреляции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Относительная распространенность преобладающих типов в норме и при хроническом пародонтите. Гистограмма, сравнивающая среднюю относительную распространенность преобладающих типов, обнаруженную у здоровых людей (исходный уровень) и у пациентов с хроническим пародонтитом (поверхностный зубной налет). Статистически значимые различия, указанные t-тестами для двух выборок, выделены знаком *, а показанные планки ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s005

(TIF)

Рисунок S6.

Относительная численность преобладающих типов во время индукции экспериментального гингивита. Диаграмма гистограммы, сравнивающая среднюю относительную численность преобладающих типов в разные моменты времени экспериментального гингивита. Статистически значимые различия, указанные t-тестами для двух выборок, выделены знаком *, а показанные планки ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s006

(TIF)

Рисунок S7.

Филогенетическое древо, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Mollicutes _CP6_C1, представителями типа Firmicutes и другими типами, обнаруженными в ротовой полости. Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора. Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев.Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s007

(PDF)

Рисунок S8.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Propionibacteriaceae HS10_B_C3 и представителями филума Actinobacteria . Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора.Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s008

(PDF)

Рисунок S9.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Alloprevotella _HS3_1W_C6 и представителями родов Alloprevotella и Prevotella . Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора.Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s009

(PDF)

Рисунок S10.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Actinomyces _HS14_2W_C6 и представителями рода Actinomyces . Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора.Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s010

(PDF)

Рисунок S11.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Bergeyella _HS1_1W_C3, представителями рода Bergeyella и другими представителями класса Flavobacteria в типе Bacteroidetetes .Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора. Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s011

(PDF)

Рисунок S12.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Tannerella CP6_C2 и представителями родов Tannerella и Porphyromonas .Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора. Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s012

(PDF)

Рисунок S13.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Leptotrichia CP4_C6 и представителями рода Leptotrichia .Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора. Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s013

(PDF)

Рисунок S14.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Aggregatibacter _HS19_2W_I12 и представителями родов Aggregatibacter и Haemophilus .Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора. Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s014

(PDF)

Рисунок S15.

Филогенетическое дерево, основанное на сравнении генов 16S рРНК, показывающее родство между Capnocytophaga _HS5_2W_I24 и представителями рода Capnocytophaga .Дерево было построено с использованием метода объединения соседей из матрицы расстояний, построенной из выровненных последовательностей с использованием поправки Юкса-Кантора. Числа представляют значения начальной загрузки для каждой ветви на основе данных из 500 деревьев. Шкала баров показывает количество нуклеотидных замен на сайт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s015

(PDF)

Таблица S2.

ОТЕ, связанные с временными точками экспериментального гингивита. OTU были связаны с временными точками экспериментального гингивита с использованием многомерной ассоциации с линейными моделями (MaAsLin).OTU ранжируются в соответствии с их значением P . Перечисленные OTU имеют значения P <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s017

(DOC)

Набор данных S1.

Относительное содержание первых 50 OTU в образцах зубного налета. HS  =  Здоровый субъект, 1W  = 1 неделя, 2W  = 2 недели, CP  =  Пациент с хроническим пародонтитом, Sub  =  поддесневой налет, Цифры обозначают номер субъекта или пациента. Приведенные значения представляют собой процент от общего числа последовательностей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071227.s020

(XLS)

Благодарности

Трейси Чаплин-Перкинс выражает благодарность за помощь в пиросеквенировании. Д-р Цуте Чен и д-р Флойд Дьюхерст выражают благодарность за проведение пакетного анализа данных BLAST по сравнению с эталонным набором данных HOMD.

Вклад авторов

Идея и разработка экспериментов: JK VB DB WW. Выполняли опыты: Ю.К. В.Б. Проанализированы данные: JK VB WW.Написал статью: JK VB WW.

Каталожные номера

1. 1. Schatzle M, Loe H, Burgin W, Anerud A, Boysen H, et al. (2003) Клиническое течение хронического пародонтита. I. Роль гингивита. J Clin Periodontol 30: 887–901.
2. 2. Чаглар Э., Каргул Б., Танбога И. (2005) Роль бактериотерапии и пробиотиков в здоровье полости рта. Устный Дис 11: 131–137.
3. 3. He X, Lux R, Kuramitsu HK, Anderson MH, Shi W (2009)Достижение пробиотических эффектов посредством модулирования микробной экологии полости рта.Adv Dent Res 21: 53–56.
4. 4. Wade Wade (2010) Новые аспекты и новые концепции поддержания «микробиологического» здоровья. Стоматологический журнал 38: S21–S25.
5. 5. Телес Р., Телес Ф., Фриас-Лопес Дж., Пастер Б., Хаффаджи А. (2013) Извлеченные и невыученные уроки в микробиологии пародонта. Пародонтология 2000 62: 95–162.
6. 6. Loe H, Theilade E, Jensen SB (1965) Экспериментальный гингивит у человека. J Периодонтол 36: 177–187.
7. 7. Theilade E, Wright WH, Jensen SB, Loe H (1966) Экспериментальный гингивит у человека.II. Продольное клинико-бактериологическое исследование. J Пародонтальные исследования 1: 1–13.
8. 8. Loesche WJ, Syed SA (1978)Бактериология экспериментального гингивита человека: влияние зубного налета и оценка гингивита. Infect Immun 21: 830–839.
9. 9. Мур В.Е., Холдеман Л.В., Смиберт Р.М., Гуд И.Дж., Бурмейстер Дж.А. и др. (1982) Бактериология экспериментального гингивита у молодых взрослых людей. Infect Immun 38: 651–667.
10. 10. Zee KY, Samaranayake LP, Attstrom R, Davies WI (1996) Преобладающая культивируемая микрофлора наддесневого зубного налета у китайцев.Arch Oral Biol 41: 647–653.
11. 11. Wade Wade (2004)Некультивируемые бактерии в сложных комменсальных популяциях. Adv Appl Microbiol 54: 93–106.
12. 12. Пастер Б.Дж., Олсен И., Аас Дж.А., Дьюхерст Ф.Е. (2006)Разнообразие бактерий в пародонтальном кармане человека и других участках полости рта. Пародонтол 2000 42: 80–87.
13. 13. Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE (2005)Определение нормальной бактериальной флоры полости рта. J Clin Microbiol 43: 5721–5732.
14. 14. Сокранский С.С., Хаффаджи А.Д., Куджини М.А., Смит С., Кент Р.Л. младший (1998)Микробные комплексы в поддесневом налете. J Clin Periodontol 25: 134–144.
15. 15. Бик Э.М., Лонг К.Д., Армитаж Г.К., Лумер П., Эмерсон Дж. и др. (2010) Бактериальное разнообразие в ротовой полости 10 здоровых людей. ИСМЕ J 4: 962–974.
16. 16. Кумар П.С., Гриффен А.Л., Бартон Дж.А., Пастер Б.Дж., Мёшбергер М.Л. и др. (2003)Новые виды бактерий, связанные с хроническим пародонтитом.Дж. Дент Рез. 82: 338–344.
17. 17. Ротберг Дж. М., Лимон Дж. Х. (2008) Развитие и влияние секвенирования 454. Nat Biotechnol 26: 1117–1124.
18. 18. Гриффен А.Л., Билл С.Дж., Кэмпбелл Дж.Х., Файрстоун Н.Д., Кумар П.С. и др. (2012)Отчетливые и сложные бактериальные профили при пародонтите и здоровье человека, выявленные с помощью пиросеквенирования 16S. ИСМЕ J 6: 1176–1185.
19. 19. Абуслеме Л., Дюпюи А.К., Дютзан Н., Сильва Н., Бурлесон Дж.А. и соавт. (2013) Поддесневой микробиом в норме и пародонтите и его связь с биомассой сообщества и воспалением.ИСМЕ J 7: 1016–1025.
20. 20. Хуан С., Ян Ф., Цзэн С., Чен Дж., Ли Р. и др. (2011) Предварительная характеристика микробиоты полости рта взрослых китайцев с гингивитом и без него. BMC Oral Health 11: 33.
21. 21. Диас П.И., Чалмерс Н.И., Рикард А.Х., Конг С., Милберн С.Л. и соавт. (2006) Молекулярная характеристика предметно-специфичной микрофлоры полости рта при начальной колонизации эмали. Appl Environ Microbiol 72: 2837–2848.
22. 22. Диаз П.И., Дюпюи А.К., Абуслеме Л., Риз Б., Обергфелл С. и соавт.(2012) Использование высокопроизводительного секвенирования для изучения биоразнообразия бактериальных сообществ полости рта. Мол Оральный микробиол 27: 182–201.
23. 23. Kroes I, Lepp PW, Relman DA (1999)Бактериальное разнообразие в поддесневой щели человека. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 14547–14552.
24. 24. Armitage GC (1996) Заболевания пародонта: диагностика. Энн Пародонтол 1: 37–215.
25. 25. Силнесс Дж., Лоэ Х. (1964) Заболевание пародонта во время беременности. II. Корреляция между гигиеной полости рта и состоянием пародонта.Acta Odontol Scand 22: 121–135.
26. 26. Франк Дж.А., Райх С.И., Шарма С., Вайсбаум Дж.С., Уилсон Б.А. и соавт. (2008) Критическая оценка двух праймеров, обычно используемых для амплификации бактериальных генов 16S рРНК. Appl Environ Microbiol 74: 2461–2470.
27. 27. Лейн Д.Дж., Пейс Б., Олсен Г.Дж., Шталь Д.А., Согин М.Л. и др. (1985) Быстрое определение последовательностей 16S рибосомной РНК для филогенетического анализа. Proc Natl Acad Sci U S A 82: 6955–6959.
28. 28. Fierer N, Hamady M, Lauber CL, Knight R (2008)Влияние пола, рук и мытья рук на разнообразие бактерий на поверхности рук.Proc Natl Acad Sci USA 105: 17994–17999.
29. 29. Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T, Hall JR, Hartmann M, et al. (2009) Представляем mothur: открытое, независимое от платформы, поддерживаемое сообществом программное обеспечение для описания и сравнения микробных сообществ. Appl Environ Microbiol 75: 7537–7541.
30. 30. Шлосс П.Д., Геверс Д., Весткотт С.Л. (2011)Уменьшение влияния ПЦР-амплификации и артефактов секвенирования на исследования на основе 16S рРНК. PLoS One 6: e27310.
31. 31. Айва С., Ланзен А., Давенпорт Р.Дж., Тернбо П.Дж. (2011)Удаление шума из пиросеквенированных ампликонов. BMC Биоинформатика 12: 38.
32. 32. Pruesse E, Quast C, Knittel K, Fuchs BM, Ludwig W, et al. (2007) SILVA: всеобъемлющий онлайн-ресурс для проверенных и выровненных данных о последовательностях рибосомных РНК, совместимых с ARB. Nucleic Acids Res 35: 7188–7196.
33. 33. Edgar RC, Haas BJ, Clemente JC, Quince C, Knight R (2011) UCHIME повышает чувствительность и скорость обнаружения химер.Биоинформатика 27: 2194–2200.
34. 34. Chen T, Yu WH, Izard J, Baranova OV, Lakshmanan A, et al. (2010) База данных микробиома ротовой полости человека: доступный в Интернете ресурс для исследования таксономической и геномной информации о микробах ротовой полости. База данных (Оксфорд) 2010: baq013.
35. 35. Scholz CF, Poulsen K, Kilian M (2012)Новый молекулярный метод идентификации Streptococcus pneumoniae, применимый к клинической микробиологии и исследованиям микробиома на основе последовательности 16S рРНК.Дж. Клин Микробиол 50: 1968–1973.
36. 36. Good IJ (1953) Частота популяций видов и оценка параметров популяции. Биометрика 40: 237–264.
37. 37. Симпсон Э.Х. (1949) Измерение разнообразия. Природа 163: 688–688.
38. 38. Чао А. (1984) Непараметрическая оценка количества классов в популяции. Скандинавский статистический журнал 11: 265–270.
39. 39. Бунге Дж. (2011) Оценка количества видов с улавливанием.Тихоокеанский симпозиум по биокомпьютингу Тихоокеанский симпозиум по биокомпьютингу: 121–130.
40. 40. Юэ Дж. К., Клейтон М. К. (2005) Мера сходства, основанная на пропорциях видов. Коммунальная статистическая теория М 34: 2123–2131.
41. 41. Эванс Дж., Шенеман Л., Фостер Дж. (2006)Расслабленное соединение соседей: метод быстрого построения филогенетического дерева на основе расстояния. Журнал молекулярной эволюции 62: 785–792.
42. 42. Лозупоне К.А., Найт Р. (2008)Разнообразие видов и измерение микробного разнообразия.FEMS Microbiol Rev 32: 557–578.
43. 43. Excoffier L, Smouse PE, Quattro JM (1992) Анализ молекулярной дисперсии, выведенный из метрических расстояний между гаплотипами ДНК: применение к данным об ограничении митохондриальной ДНК человека. Генетика 131: 479–491.
44. 44. Слаткин М., Мэддисон В.П. (1990) Обнаружение изоляции на расстоянии с использованием филогении генов. Генетика 126: 249–260.
45. 45. Morgan XC, Tickle TL, Sokol H, Gevers D, Devaney KL, et al.(2012)Дисфункция микробиома кишечника при воспалительных заболеваниях кишечника и лечении. Геном Биол 13: R79.
46. 46. Сегата Н., Изард Дж., Уолдрон Л., Геверс Д., Миропольски Л. и др. (2011)Открытие и объяснение метагеномных биомаркеров. Геном Биол 12: R60.
47. 47. де Лилло А., Эшли Ф.П., Палмер Р.М., Мансон М.А., Кириаку Л. и др. (2006) Новые филотипы поддесневых бактерий, обнаруженные с использованием нескольких универсальных наборов праймеров для полимеразной цепной реакции. Oral Microbiol Immunol 21: 61–68.
48. 48. Моаззез Р., Томпсон Х., Палмер Р.М., Уилсон Р.Ф., Проктор Г.Б. и др. (2011) Влияние полоскания рта этанолсодержащими ополаскивателями на выработку ацетальдегида в слюне. Eur J Oral Sci 119: 441–446.
49. 49. Лазаревич В., Уайтсон К., Хьюз С., Эрнандес Д., Фаринелли Л. и др. (2009) Метагеномное исследование микробиоты полости рта с помощью высокопроизводительного секвенирования Illumina. J Microbiol Methods 79: 266–271.
50. 50. Keijser BJ, Zaura E, Huse SM, van der Vossen JM, Schuren FH, et al.(2008) Пиросеквенирующий анализ микрофлоры полости рта здоровых взрослых. Дж. Дент Рез. 87: 1016–1020.
51. 51. Ли Л., Сяо В.В., Нандакумар Р., Барбуто С.М., Монгодин Э.Ф. и соавт. (2010)Анализ эндодонтических инфекций с помощью пиросеквенирования с глубоким покрытием. Дж. Дент Рез. 89: 980–984.
52. 52. Zaura E, Keijser BJ, Huse SM, Crielaard W (2009) Определение здорового «основного микробиома» микробных сообществ полости рта. BMC Microbiol 9: 259.
53. 53. Ritz HL (1967)Изменения популяции микробов при формировании зубного налета у человека.Арх Орал Биол 12: 1561–1568.
54. 54. Белда-Ферре П., Алькарас Л.Д., Кабрера-Рубио Р., Ромеро Х., Симон-Соро А. и др. (2011) Оральный метагеном в норме и болезни. ИСМЕ J 6: 46–56.
55. 55. Leys EJ, Lyons SR, Moeschberger ML, Rumpf RW, Griffen AL (2002) Ассоциация Bacteroides forsythus и нового филотипа Bacteroides с пародонтитом. J Clin Microbiol 40: 821–825.
56. 56. Zuger J, Luthi-Schaller H, Gmur R (2007) Некультивируемые Tannerella BU045 и BU063 представляют собой тонкосегментированные нитевидные палочки с высокой распространенностью, но низкой распространенностью в зубных бляшках, связанных с воспалительными заболеваниями.Микробиология 153: 3809–3816.
57. 57. Мур В.Е., Мур Л.В. (1994) Бактерии заболеваний пародонта. Пародонтол 2000 5: 66–77.
58. 58. Wu CC, Johnson JL, Moore WE, Moore LV (1992) Исправленные описания Prevotella denticola, Prevotella loescheii, Prevotella veroralis и Prevotella melaninogenica. Int J Syst Bacteriol 42: 536–541.

Предварительная характеристика микробиоты полости рта взрослых китайцев с гингивитом и без него | BMC Oral Health