BODIPY FL Верапамил

Как и дигидропиридин, фенилалкиламины также связываются с α ₁ -субъединицей каналов L-типа Ca ²⁺ и блокируют транспорт Ca ²⁺ .Мы предлагаем зеленое флуоресцентное производное BODIPY FL (B7431) верапамила, фенилалкиламина, который, как известно, ингибирует опосредованный Р-гликопротеином отток лекарств.

Р-гликопротеин массой 170 000 дальтон обычно сверхэкспрессируется в опухолевых клетках, которые приобрели устойчивость к различным противоопухолевым препаратам (зонды для клеточной адгезии, хемотаксиса, множественной лекарственной устойчивости и глутатиона — раздел 15.6). Считается, что Р-гликопротеин опосредует АТФ-зависимый отток или секвестрацию структурно несвязанных молекул, включая актиномицин D, антрациклины, колхицин, эпиподофиллотоксины и винбластин.Верапамил, по-видимому, ингибирует отток лекарств, действуя в качестве субстрата Р-гликопротеина, тем самым подавляя способность переносчика выводить лекарства. Верапамил BODIPY FL также служит субстратом для P-гликопротеина. Это флуоресцентное производное верапамила преимущественно накапливается в лизосомах нормальных, чувствительных к лекарственным средствам клеток NIH 3T3, но быстро транспортируется из клеток с множественной лекарственной устойчивостью.

Производные эозина: ингибиторы кальциевой помпы

Изотиоцианат эозина (Е18) является мощным обратимым ингибитором кальциевой помпы плазматической мембраны эритроцитов с полумаксимальной ингибирующей концентрацией <0.2 мкМ. Изотиоцианат эозина также необратимо реагирует в месте связывания АТФ этого кальциевого насоса. Сукцинимидиловый эфир диацетата карбоксиэозина (C22803), производное эозина, проникающее в клеточную мембрану, также ингибирует насос Ca ²⁺ плазматической мембраны эритроцитов. Изотиоцианат флуоресцеина (F143, серия красителей BODIPY — раздел 1.4) является более слабым ингибитором кальциевой помпы плазматической мембраны эритроцитов.

Датчик кальция Premo Cameleon

Линейка продуктов Premo сочетает в себе генетически закодированные индикаторы ионов и датчики окружающей среды с эффективной доставкой BacMam (технология доставки и экспрессии генов BacMam — примечание 11.1) для внутриклеточных измерений в клетках млекопитающих. Premo Cameleon Calcium Sensor (P36207, P36208) представляет собой логометрический чувствительный к кальцию флуоресцентный белок, который доставляется посредством трансдукции, опосредованной бакуловирусом BacMam, в различные типы клеток млекопитающих. Эта система содержания и доставки обеспечивает эффективный и надежный метод измерения мобилизации Ca ²⁺ в трансдуцированных клетках с использованием анализов на микропланшетах или флуоресцентной микроскопии ().

Датчик кальция Premo Cameleon основан на датчике YC3.60 версия семейства сенсоров на основе флуоресцентного белка (FP) (cameleon), разработанная Tsien, Miyawaki et al., которая, как сообщается, имеет константу диссоциации Ca ²⁺ , равную 240 нМ. Сенсор содержит два флуоресцентных белка (усиленный голубой флуоресцентный белок или ECFP и вариант желтого флуоресцентного белка Venus или YFP), связанные кальмодулин-связывающим пептидом М13 и кальмодулином. При связывании четырех ионов кальция кальмодулин претерпевает конформационные изменения, оборачиваясь вокруг пептида М13, что изменяет эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между флуорофорами донора CFP и акцептора YFP ( Рисунок 16.3.1 ). После этого конформационного изменения происходит увеличение эмиссии YFP (525–560 нм) и одновременное снижение эмиссии CFP (460–500 нм) ( Рисунок 16.3.2 ), что делает Cameleon эффективным репортером мобилизации кальция. Рационометрические показания датчика кальция Premo Cameleon — увеличение эмиссии YFP (535 нм, зелено-желтая эмиссия) и снижение эмиссии CFP (485 нм, синее излучение) — уменьшают вариации результатов анализа из-за аутофлуоресценции соединений или клеток, неоднородного клеточного покрытия. , различия в уровнях экспрессии между клетками, нестабильность освещения прибора и изменения длины пути освещения.

Датчик кальция Premo Cameleon предназначен для быстрого и точного определения потока внутриклеточного кальция от различных рецепторов. Были протестированы стандартные фармакологические анализы для нескольких агонистов и антагонистов GPCR. Пример надежности, воспроизводимости и точности системы продемонстрирован с использованием эндогенного гистаминового рецептора в сочетании с гистамином, пириламином и тиоперамидом в клетках HeLa (, рис. 16.3.3, ). Уровни экспрессии будут поддерживаться в течение нескольких дней, что позволит проводить повторные анализы; например, при изучении отношений агонист/антагонист на одних и тех же клетках.

Рисунок 16.3.2 Спектры флуоресценции датчика кальция Premo Cameleon (P36207, P36208). Пунктирной линией показаны спектры в отсутствие Ca ²⁺ ; сплошная линия показывает изменение на основе переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) при связывании Ca ²⁺ .

Зонды для Na

Аналоги амилорида: зонды для канала Na

Уабаин Зонды для Na

Уабаин относится к классу гликозилированных стероидов, известных под общим названием сердечные гликозиды, благодаря их терапевтической эффективности при лечении застойной сердечной недостаточности. Уабаин достигает этого эффекта, связываясь с каталитической α-субъединицей Na ⁺ /K ⁺ -АТФазы и ингибируя ее транспорт Na ⁺ через плазматическую мембрану. 9-Антроилуабаин (A1322) полезен для локализации Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы и для изучения ее мембранной ориентации, подвижности и динамики.Антроилуабаин также использовался для исследования активного центра Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы, ингибирования и конформационных изменений, а также для исследования кинетики связывания сердечных гликозидов. Уабаин BODIPY FL (B23461) использовался в сочетании с холерным токсином B Alexa Fluor 555 (C22843, Зонды для отслеживания связывания рецепторов и фагоцитоза — раздел 16.1) для визуализации Na ⁺ /K ⁺ -АТФазы и ганглиозида G _{M1 Локализация домена} в плазматических мембранах лимфоцитов.

Использование технологии BacMam для доставки и экспрессии кДНК с натриевыми каналами

кДНК с натриевыми каналами, которые были сконструированы в бакуловирусную систему доставки/экспрессии генов с использованием технологии BacMam (технология доставки и экспрессии генов BacMam — примечание 11.1), включая кДНК Nav1.2 (B10341) и кДНК Nav1.5 (B10335).

Система BacMam использует модифицированный бакуловирус клеток насекомых в качестве носителя для эффективной доставки и экспрессии генов в клетки млекопитающих с минимальными усилиями и токсичностью.Использование доставки BacMam в клетки млекопитающих является относительно новым, но хорошо описанным и широко применялось при разработке лекарств. Кроме того, было показано, что конститутивно экспрессируемые ионные каналы и другие белки клеточной поверхности вносят вклад в клеточную токсичность в некоторых системах и могут быть подвержены дрейфу клонов и другим несоответствиям, которые препятствуют успешным экспериментам и скринингу. Таким образом, временные системы экспрессии, такие как система доставки и экспрессии генов BacMam, все чаще становятся предпочтительными методами для снижения вариабельности экспрессии в таких анализах.Было показано, что клетки

U2OS (номер ATCC HTB-96) демонстрируют высокоэффективную экспрессию доставляемых BacMam мишеней на нулевом фоне, что идеально подходит для скрининга в гетерологичной системе экспрессии. Клеточная линия U2OS рекомендуется для использования, если ваша конкретная клеточная линия не экспрессирует эффективно мишени BacMam. Примеры других клеточных линий, которые эффективно трансдуцируются с помощью технологии BacMam, включают HEK 293, HepG2, BHK, Cos-7 и Saos-2.

Датчики для K

Глибенкламид Зонды для АТФ-зависимого канала К

Глибенкламид блокирует АТФ-зависимый канал К ⁺ , тем самым вызывая секрецию инсулина.Мы подготовили зеленый флуоресцентный глибенкламид BODIPY FL (BODIPY FL глибурид, E34251) и красный флуоресцентный глибенкламид BODIPY TR (BODIPY TR глибурид, E34250) в качестве зондов для АТФ-зависимого канала K ⁺ . BODIPY TR глибенкламид использовался для обнаружения рецепторов сульфонилмочевины, связанных с АТФ-зависимыми каналами K ⁺ в бычьих моноцитах и ​​β-клетках, а также для маркировки нового митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала в головном мозге.

Рецепторы сульфонилмочевины АТФ-зависимых К+ каналов хорошо видны в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР).Поэтому, поскольку эти зонды также являются эффективными красителями живых клеток для ER, глибенкламид BODIPY FL и глибенкламид BODIPY TR также обозначаются как ER-Tracker Green и ER-Tracker Red соответственно; см. «Зонды для эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи — раздел 12.4» для описания этого приложения. Вариабельная экспрессия рецепторов сульфонилмочевины в некоторых специализированных типах клеток может привести к мечению не-ER этими зондами.

Анализ ионных каналов калия FluxOR

Наборы для анализа ионных каналов калия FluxOR (F10016, F10017) обеспечивают анализ на основе флуоресценции для высокопроизводительного скрининга активности ионных каналов и транспортеров калия.Наборы FluxOR для анализа ионных каналов калия используют хорошо описанную проницаемость калиевых каналов для ионов таллия (Tl ⁺ ). Когда таллий присутствует во внеклеточном растворе, содержащем стимул для открытия калиевых каналов, активность каналов выявляют с помощью проникающего в клетку индикаторного красителя таллия, который сообщает о значительном увеличении эмиссии флуоресценции при 525 нм по мере того, как таллий стекает по градиенту концентрации в клетки. Рисунок 16.3.4 ). Таким образом, флуоресценция, зарегистрированная в системе FluxOR, становится суррогатным индикатором активности любого ионного канала или переносчика, проницаемого для таллия, включая человеческий канал, связанный с эфиром (hERG), один из человеческих калиевые каналы сердца.Анализ ионных каналов калия FluxOR был подтвержден для гомогенного высокопроизводительного профилирования ингибирования канала hERG с использованием временной экспрессии hERG, опосредованной BacMam (см. ниже). Наборы FluxOR для анализа ионных каналов калия также можно использовать для изучения процессов котранспорта калия, обеспечивающих перенос таллия в клетки. Кроме того, покоящиеся калиевые каналы и калиевые каналы внутреннего выпрямителя, такие как Kir2.1, могут быть проанализированы путем добавления стимулирующего буфера только с таллием без какой-либо деполяризации для измерения сигнала.

Реактив FluxOR, индикаторный краситель таллия, загружается в клетки в виде проницаемого для мембран эфира AM. Нагрузке способствует запатентованный концентрат PowerLoad, оптимизированный состав неионогенных поверхностно-активных полиолов Pluronic, которые диспергируют и стабилизируют красители на основе сложных эфиров AM для оптимальной загрузки в водном растворе. Этот концентрат PowerLoad также доступен отдельно (P10020) для облегчения солюбилизации водонерастворимых красителей и других материалов в физиологических средах.

Попав внутрь клетки, нефлуоресцентный AM-эфир красителя FluxOR расщепляется эндогенными эстеразами на слабофлуоресцентный (базальная флуоресценция), чувствительный к таллию индикатор.Чувствительная к таллию форма сохраняется в цитозоле, а ее экструзия ингибируется водорастворимым пробенецидом (P36400, Хелаторы, калибровочные буферы, ионофоры и реагенты для загрузки клеток — раздел 19.8), который блокирует насосы органических анионов. В большинстве случаев клетки загружаются красителем при комнатной температуре. Для достижения наилучших результатов буфер для загрузки красителя затем заменяют свежим, не содержащим красителей буфером для анализа (состоящим из физиологического HBSS, содержащего пробенецид), и клетки готовы к анализу скрининга с высокой пропускной способностью.

Каждый флуксор ионно-канальный канал ASTAY содержит:

• флуксорский анализ
• флуксорский буфер
• Probenload Conctrate
• Probenecid
• Flucer Chloride Buffer
• Сульфат калия (K ₂ SO ₄ ) концентрат
• Thallium сульфат (TL ₂ SO ₄ ) концентрат ₄ ) концентрат _{4 диметилсульфоксид (ДМСО)}
• подробные протоколы (анализ канала ионного канала флюкспорта)

. Наборы флуксорных наборов обеспечивают концентрированный таллийский раствор наряду с достаточным количеством краситель и буферы для выполнения ~4000 (F10016) или ~40000 (F10017) анализов в формате 384-луночных микропланшетов.Эти комплекты обеспечивают максимальную целевую гибкость и простоту работы в однородном формате. Анализ ионных каналов калия FluxOR был продемонстрирован для использования с клетками CHO и HEK 293, стабильно экспрессирующими hERG, а также с клетками U2OS, временно трансдуцированными реагентом BacMam hERG (B10019, B10033; см. ниже) ( рис. 16.3.5 ).

Рисунок 16.3.4 Перераспределение таллия в анализе FluxOR. Базальная флуоресценция клеток, загруженных реагентом FluxOR (предоставляется в наборах FluxOR для анализа ионных каналов калия; F10016, F10017), низкая, когда калиевые каналы остаются нестимулированными, как показано на левой панели.Когда таллий добавляется в анализ со стимулом, таллий стекает по градиенту концентрации в клетки, активируя краситель, как показано на правой панели.
Рис. 16.3.5 Анализ ионных каналов калия FluxOR (F10016, F10017), выполненный на свежих и замороженных клетках U2OS, трансдуцированных реагентом BacMam hERG (B10019, B10033). A) Необработанные данные (RFU = относительные единицы флуоресценции), полученные в анализе FluxOR для определения потока таллия в клетках U2OS, трансдуцированных BacMam-hERG и хранившихся замороженными до дня использования.Стрелка указывает на добавление таллия/калиевого стимула, а верхняя и нижняя линии указывают на данные, взятые из минимальной и максимальной доз цизаприда, использованных при определении кривых доза-реакция. B) Необработанные значения пика и исходного уровня перед стимулом были усреднены и нормализованы, и они указывают на кратное увеличение флуоресценции с течением времени. C) Данные, полученные при определении дозозависимого блока цизаприда на BacMam hERG, экспрессированном в клетках U2OS, свежеполученных в результате экспрессии в течение ночи после вирусной трансдукции.D) Параллельные данные, полученные из клеток, трансдуцированных BacMam-hERG, хранившихся в течение 2 недель в жидком азоте, оттаивших и высеянных за 4 часа до проведения анализа. Столбики погрешностей указывают на стандартное отклонение, n = 4 на определение.

Использование технологии BacMam для доставки и экспрессии кДНК калиевого канала

кДНК калиевого канала, которые были сконструированы в системе доставки/экспрессии генов бакуловируса с использованием технологии BacMam (технология доставки и экспрессии генов BacMam — примечание 11.1) также доступны для использования с наборами FluxOR для анализа ионных каналов калия, включая ген, связанный с эфиром человека (hERG) ( рис. 16.3.6 ), несколько представителей потенциалзависимого K семейство генов каналов (Kv) и два члена семейства генов внутреннего выпрямления K ⁺ каналов (Kir):

• BacMam hERG (на 10 микропланшетов, B10019; на 100 микропланшетов, B10033)
• BacMam Kv1 (на 10 микропланшетов, B10331)
• BacMam Kv1.3 (на 10 микропланшетов, B10332)
• BacMam Kv2.1 (на 10 микропланшетов, B10333)
• BacMam Kv7.2 и Kv7.3 (на 10 микропланшетов, B10147)
• BacMam Kir1.1 (на 10 микропланшетов, B10334) )
• BacMam Kir2.1 (для 10 микропланшетов, B10146)

В системе BacMam используется модифицированный бакуловирус клеток насекомых в качестве носителя для эффективной доставки и экспрессии генов в клетки млекопитающих с минимальными усилиями и токсичностью. Использование доставки BacMam в клетки млекопитающих является относительно новым, но хорошо описанным и широко применялось при разработке лекарств.Кроме того, было показано, что конститутивно экспрессируемые ионные каналы и другие белки клеточной поверхности вносят вклад в клеточную токсичность в некоторых системах и могут быть подвержены дрейфу клонов и другим несоответствиям, которые препятствуют успешным экспериментам и скринингу. Таким образом, индуцируемые, задержанные делением или транзиторные системы экспрессии, такие как технология BacMam, все чаще становятся предпочтительными методами для снижения вариабельности экспрессии в таких анализах.

Было показано, что клетки U2OS (номер ATCC HTB-96) демонстрируют высокоэффективную экспрессию доставляемых BacMam мишеней на нулевом фоне, что идеально подходит для скрининга в гетерологичной системе экспрессии.Клеточная линия U2OS рекомендуется для использования, если ваша конкретная клеточная линия не экспрессирует эффективно мишени BacMam. Примеры других клеточных линий, которые эффективно трансдуцируются с помощью технологии BacMam, включают HEK 293, HepG2, BHK, Cos-7 и Saos-2.


Рисунок 16.3.6 Доставка и экспрессия гена BacMam-hERG. На этой схеме показан механизм BacMam-опосредованной доставки гена в клетку млекопитающего и экспрессия гена hERG (B10019, B10033). Ген hERG находится в бакуловирусной ДНК ниже промотора CMV, который управляет его экспрессией при введении в клетку-мишень млекопитающего.Вирусные частицы BacMam проникают в клетку эндоцитарными путями, и ДНК внутри них высвобождается для транскрипции и экспрессии. Затем транслированный белок сворачивается для встраивания в мембрану, образуя функциональные ионные каналы hERG. Этот процесс начинается в течение 4–6 часов и во многих типах клеток завершается в течение ночи.

Зонды для переносчиков анионов

Дисульфонаты стильбена: ингибиторы транспорта анионов

Мы предлагаем три дисульфоната стильбена, которые применялись для ингибирования (часто необратимого) транспорта анионов в большом количестве типов клеток млекопитающих:

Наши зонды дисульфоната стильбена, которые имеют % чистоты по данным ВЭЖХ, имеют значительно более высокую чистоту и более определенный состав, чем те, которые доступны из других коммерческих источников.DNDS был одним из ингибиторов, используемых для характеристики трех различных анионообменников в мембранах клеток почечной щеточной каймы и для сравнения этих обменников с анион-транспортным белком мембраны эритроцитов полосы-3.

Эти дисульфонаты стильбена в некоторых случаях могут специфически связываться с белками, не являющимися переносчиками анионов. Например, DIDS и H ₂ DIDS образуют комплексы специфически с гликопротеином CD4 на Т-хелперных лимфоцитах и ​​макрофагах, блокируя рост ВИЧ типа 1 на нескольких стадиях жизненного цикла вируса.

DiBAC

₄ (5)

Краситель, чувствительный к мембранному потенциалу, бис-(1,3-дибутилбарбитуровая кислота)пентаметиноксонол (DiBAC ₄ (5), B436) изначально ингибирует обмен Cl ^– с IC ₅₀ 0,146 мкМ. Однако это ингибирование со временем увеличивается до IC ₅₀ , равной 1,05 нМ, что делает DiBAC ₄ (5) более сильным ингибитором, чем DIDS, у которого IC ₅₀ составляет 31 нМ в аналогичных условиях.

Эозин малеимид

Хотя эозин-5-малеимид обычно избирательно реагирует с тиолами (E118, Тиол-реактивные зонды, возбуждаемые видимым светом — Раздел 2.2), как известно, реагирует со специфическим остатком лизина белка полосы 3 в эритроцитах человека, ингибируя анионный обмен в этих клетках и обеспечивая удобную метку для наблюдения за поведением полосы 3 в мембране. Эозин-5-изотиоцианат (Е18) имеет сходную реакционную способность с белками полосы 3.

Premo Halide Sensor

Premo Halide Sensor на основе флуоресцентного белка (P10229) представляет собой фармакологически значимый датчик для функциональных исследований лиганд- и потенциалзависимых хлоридных каналов и их модуляторов в клетках.Хлоридные каналы участвуют в столь важных и разнообразных клеточных процессах, как трансэпителиальный транспорт ионов, электрическая возбудимость, регуляция клеточного объема и ионный гомеостаз. Учитывая их физиологическое значение, следует, что дефекты их активности могут иметь серьезные последствия, включая такие состояния, как кистозный фиброз и дегенерация нейронов. Таким образом, хлоридные каналы представляют собой важные цели для открытия лекарств. Другие методы обнаружения хлоридов описаны в разделе «Обнаружение хлоридов, фосфатов, нитритов и других анионов — раздел 21».2.

Premo Halide Sensor сочетает вариант желтого флуоресцентного белка (YFP), чувствительный к ионам галогенидов, с эффективной и нецитопатической технологией доставки и экспрессии BacMam (технология доставки и экспрессии генов BacMam — примечание 11.1). Premo Halide Sensor основан на варианте Venus зеленого флуоресцентного белка (GFP) Aequorea Victoria , который демонстрирует повышенную флуоресценцию, повышенную укладку и меньшее время созревания по сравнению с YFP. Дополнительные мутации h248Q и I152L были сделаны в последовательности Венеры для повышения чувствительности флуоресцентного белка Венеры к изменениям локальной концентрации галогенидов, в частности ионов йодида.Поскольку хлоридные каналы также проницаемы для йодид-иона (I), йодид можно использовать в качестве заменителя хлорида. При стимуляции открывается хлоридный канал или транспортер, и йодид поступает по градиенту концентрации в клетки, где он гасит флуоресценцию экспрессируемого премогалогенидного сенсорного белка (, рис. 16.3.7, ). Уменьшение флуоресценции Premo Halide Sensor прямо пропорционально потоку ионов и, следовательно, активности хлоридного канала или переносчика. Галогенный датчик Premo показывает профиль возбуждения и эмиссии, аналогичный YFP (, рис. 16.3.8 ) и могут быть обнаружены с помощью стандартных наборов фильтров GFP/FITC или YFP. Чувствительные к галоидам конструкции на основе YFP ​​в сочетании с гашением йодидом использовались в высокопроизводительном скрининге (HTS) для идентификации модуляторов активируемых кальцием хлоридных каналов.

Галогенный датчик Premo (P10229) предварительно упакован и готов к немедленному использованию. Он содержит все компоненты, необходимые для клеточной доставки и экспрессии, включая бакуловирус, несущий генетически кодируемый биосенсор, энхансер BacMam и стимулирующий буфер.Было продемонстрировано, что Premo Halide Sensor трансдуцирует несколько клеточных линий, включая BHK, U2OS, HeLa, CHO и первичные бронхиальные эпителиальные клетки человека (HBEC), обеспечивая гибкость анализа проницаемых для хлора каналов в широком диапазоне клеточных моделей. Чтобы отделить обслуживание и подготовку клеток от скрининга клеток, клетки, трансдуцированные BacMam, можно разделить на аликвоты и заморозить для последующего анализа. Как стабильные клеточные линии, так и первичные клетки человека могут быть получены замороженными и «готовыми к анализу», а затем могут быть высеяны всего за четыре часа до скрининга.Скрининг можно проводить в полной среде и без каких-либо стадий промывки. Анализы хлоридных каналов с помощью Premo Halide Sensor совместимы со стандартными флуоресцентными платформами HTS.

Рисунок 16.3.7 Принцип действия датчика Premo Halide Sensor (P10229): перераспределение йодида при активации хлоридного канала. Базальная флуоресценция датчика Premo Halide Sensor высока, когда хлоридные каналы закрыты или заблокированы. После активации (открытия) хлоридных каналов ионы йодида проникают в клетку по градиенту концентрации и гасят флуоресценцию от Premo Halide Sensor


(рис. 16).3.8 Тушение флуоресценции премогалогенидного сенсора за счет повышения концентрации йодида и хлорида. Клетки U2OS трансдуцировали с помощью Premo Halide Sensor. Через 24 часа клетки трипсинизировали и лизировали ресуспендированием в стерильной дистиллированной воде. Тушение флуоресценции лизата исследовали с использованием возрастающих концентраций NaCl (А) и NaI (В). Йодид вызывает значительно большее гашение флуоресценции Premo Halide Sensor, чем хлорид.

5 2

MW	MW	MW	Roady	ABS	ABS	EC	EM	EM	Notes	Notes
A1322	788.89	F, D, L	ДМСО	362	7500	471	МеОН
B436	542,67	л	ДМСО, этанол	590	160000	616		МеОН 1
	B7431 769,18	F, D, L	ДМСО, этанол	504	74000	511		МеОН
	B23461 858.74	F, D, L	ДМСО	503	80000	510	МеОН
C22803	873,05	F, D	ДМСО	<300		ни
D337	498,47	Ж, ДД	Н 2 О	341	61000	415	Н 2 О	2
D338	500.48	Ж, ДД	Н 2 О	286	41 000	ни	МеОН	2
D673	474,32	л	Н 2 О	352	32000	ни	Н 2 О
D7443	686,48	F, D, L, А	ДМСО, этанол	504	83000	511	МеОН
Е18	704.97	F, DD, L	PH> 6, DMF	521	521	95 000	544	pH 9	2
E3111	316.22	D 2 О, МеОН	378	23000	423	МеОН
E34250	915,23	F, D, L	ДМСО, Н 2 О	587	60000	615	МеОН
E34251	783.10	F, D, L	DMSO, H 2 O	504	76 000	511	511	MeOH
S7445	760.57	F, D, L, A	ДМСО, EtOH	565	143,000	570	МеОН
x 902 может потребоваться добавление растворимого основания к асолу. Изотиоцианаты неустойчивы в воде и не должны храниться в водном растворе.

A1322, B436, B7431, B23461, C22803, D337, D338, D673, D7443, Е18, E3111, S7445, F10016, F10017, P10229, P36207, P36208, E34250, E34251, B10019, B10033, B10146,B10147,B10331,B10332,B10333,B10334,B10335,B10341,P10020

Валиномицин – обзор | ScienceDirect Topics

3.3.1 Валиномицин и нонактин

Валиномицин представляет собой нейтральный циклический додекапсипептидный антибиотик с 36-членным кольцом, а нонактин представляет собой нейтральный макротетралидный антибиотик с 32-членным кольцом [2, 43-45].Оба являются гидрофобными и сильно распределяются в углеводородной области мембраны. Они также связывают K ⁺ с некоторой специфичностью. Присутствуя в БЛМ, эти молекулы вступают в реакции ассоциации-диссоциации с водным раствором К ⁺ на границе раздела мембрана-вода, замещая гидратную оболочку К ⁺ полярной молекулярной клеткой. Катионный комплекс, однако, все еще достаточно гидрофобен, чтобы оставаться растворенным в мембране, таким образом, он может «переносить» K ⁺ через внутреннюю часть мембраны под действием приложенного электрического поля.Межфазные реакции ассоциации-диссоциации следуют законам действующих масс, поэтому концентрация комплекса, образующегося на каждой границе раздела, пропорциональна концентрации водного K ⁺ на границе раздела.

Если К ⁺ присутствует в равной степени с обеих сторон мембраны, то проводимость мембраны G пропорциональна [К ⁺ ]. Однако релевантна межфазная концентрация [K ⁺ ] ₀ : G ∞ [K ⁺ ] ₀ .Если мембрана заряжена и имеет электростатический поверхностный потенциал ψ ₀ , то [K ⁺ ] ₀ определяется соотношением Больцмана: [K ⁺ ] ₀ = [K ^{+ + ] _объем exp( −eψ ₀ / kT ). Поэтому измерение G дает информацию о ψ ₀ . Чтобы провести, заряженный комплекс должен перепрыгнуть через гидрофобный и дипольный энергетические барьеры внутри бислоя.Эти эффекты входят в константу пропорциональности выше. Один тип эксперимента проводится в симметричных условиях, когда концентрация ионофора и объем [K + ] поддерживаются постоянными, а заряженный адсорбент добавляется симметрично в обе водные камеры. Если адсорбент вызывает сдвиг поверхностного потенциала Δ ψ ₀ , то}

(5)Δψ0=−kTeln(G2/G1),

, где 2 – измеренные проводимости до и после добавления соответственно [45].В уравнении (5) предполагается, что сама по себе добавка не является проводящей и что ее адсорбция не влияет на дипольный или гидрофобный потенциалы. Неактиновый метод использовали McLaughlin et al. [45] для обнаружения адсорбции двухвалентных катионов на отрицательно заряженных мембранах. Погрешность этих измерений составляет около ±5 мВ.

Также возможны асимметричные эксперименты. Добавление заряженного адсорбента к одной стороне ( цис ) BLM в условиях симметричного электролита сдвигает ψ ₀ на цис сторону. ψ ₀ на стороне транс сместится, только если адсорбент пропитает мембрану и доставит заряд к поверхности транс . В дополнение к изменению проводимости вольт-амперная кривая теперь становится асимметричной. Таким образом, этот метод можно использовать для обнаружения не только адсорбции, но и проникновения заряда. Однако количественный анализ асимметрии ВАХ проблематичен, так как зависит от детальной формы энергетического барьера мембраны [46], которая обычно неизвестна.Мы использовали этот метод для наблюдения за взаимодействием заряженных липосом с нейтральными BLM, полагая, что адсорбция или полуслияние должны передавать заряд только стороне -цис-, в то время как полное слияние должно добавлять заряд к обеим сторонам. В наших условиях заряд появлялся преимущественно на -цис--стороне БЛМ [47]. Трудность в интерпретации таких экспериментов состоит в том, что однозначное отнесение наблюдаемых изменений заряда к цис- против транс- сторон мембраны невозможно.Во всех экспериментах, особенно с липосомами, необходимо контролировать, чтобы убедиться, что добавки к водной фазе цис вызывают перераспределение зонда проводимости из BLM [47].

Облегченный транспорт малых молекул и ионов для энергосберегающих мембран

В природе биологическая мембрана может избирательно транспортировать необходимые малые молекулы/ионы посредством облегченной диффузии через белки-переносчики.Заинтригованные этим явлением и принципом, исследователи мембран успешно использовали синтетические носители и обратимые реакции, опосредованные носителями, для повышения эффективности разделения синтетических мембран. Однако существующие облегченные транспортные мембраны, а также соответствующие теории облегченного транспорта едва ли были всесторонне рассмотрены в литературе. Этот обзор учебника в первую очередь охватывает два аспекта теорий облегченного транспорта: транспортные механизмы, опосредованные переносчиками, и химические процессы облегченного транспорта, включая разработку и изготовление мембран облегченного транспорта.Также обсуждалось применение мембран с облегченным транспортом в энергоемких мембранных процессах (газоразделение, первапорация и топливные элементы с протонообменной мембраной). Надеемся, что этот обзор послужит ориентиром для будущих исследований и разработок облегченных транспортных мембран с высокой энергоэффективностью.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

5 подходов к базовым вопросам хроматографии сегодня

Существует множество факторов или условий, которые могут вызвать проблемы с базовой линией в газовой хроматографии (ГХ).Загрязнение системы или газы обычно вызывают базовые возмущения. В книге «5 способов продлить срок службы газовой хроматографической колонки» обсуждаются методы, которые могут помочь предотвратить некоторые из этих проблем.

1. Шипы

Всплески — это электрические сигналы (импульсы), которые инициируются внешним событием. Всплески не являются проблемой, если они происходят на базовой линии, но если пик элюируется, всплеск может привести к ошибочному результату анализа, который придется повторить.

Всплески могут быть охарактеризованы как пики небольшой ширины, различных размеров и случайно расположенные вдоль базовой линии.Есть две основные причины выброса на базовой линии — электрические помехи и частицы, проходящие через детектор.

Электрические помехи из-за другого оборудования появляются, когда устройство в лаборатории, которое «переключается» электронным образом, непреднамеренно генерирует выбросы. Решение состоит в том, чтобы выключить его! Кроме того, ослабление контактов может вызвать электрические помехи. Изолированное или фильтрованное электропитание может помочь уменьшить помехи, создаваемые другим электрическим оборудованием.

Другим источником пиков является окисление электрических контактов.В системах обнаружения необходимо проверять соединения электродов, а также соединительные штекеры. Проблема всплеска базовой линии обсуждается в статье: Улучшенные колонки ГХ для нефтяной промышленности.

2. Шум

Шум проявляется в виде непрерывных небольших всплесков вдоль базовой линии, которые сильно отличаются от случайных больших всплесков. Небольшое количество шума присутствует в большинстве детекторов. При шумной базовой линии сначала убедитесь, что затухание установлено на соответствующем уровне.Если уровень затухания изменился, это может привести к чрезмерному шуму базовой линии.

Если внезапно появляется чрезмерный шум, причиной может быть:

• Загрязненный газ-носитель или газы детектора. Цилиндр был недавно заменен или закончился?
• Правильно ли колонка вставлена ​​в детектор? Если колонка вставлена ​​слишком глубоко в детектор, это может вызвать чрезмерный шум.
• Правильно ли установлены скорости потока газа детектора?

Если увеличение шума было постепенным, то причиной, вероятно, является загрязнение детектора.Опять же, источник загрязнения должен быть обнаружен и удален, а детектор очищен.

3. Дрифтинг

Смещение базовой линии — это постоянное увеличение или уменьшение базовой линии по мере выполнения прогона. Дрейф базовой линии может произойти после замены колонки или изменения температурных параметров, если колонка не была уравновешена новой средой. Кондиционирование столбцов для новых столбцов и сохраненных столбцов может устранить дрейф вниз.

Дрейф вверх во время цикла может указывать на загрязнение или повреждение неподвижной фазы.Если фаза повреждена, важно найти и устранить причину до замены колонки.

4. Странствие

Wander характеризуется базовой линией, которая перемещается вверх и вниз. Блуждание может быть связано с загрязнением газа-носителя, колонки или инжектора.

5. Смещение

Смещение можно описать как серию шагов базовой линии. Загрязнение инжектора, колонки или детектора может вызвать проблему. Плохое электрическое соединение и помехи от близлежащих инструментов могут вызвать смещение базовой линии.

Источник изображения

Новый ионообменный носитель на основе липосом-инкапсулированного MONTMOR

Yi Huang, ¹ QI Tao, ² Dongzhi Hou, ¹ Шэн Ху, ¹ Shuangyan Tian, ​​ ¹ Yanzhong Chen, ³ Ruyi Gui, ¹ Lingling Yang, ⁴ Yao Wang ⁵

¹ Фармацевтический колледж, Гуандунский фармацевтический университет, ² Китайская академия металлов, Китайская академия минералогии и Минеральной физики и материалов, ³ Ключевая лаборатория передовых систем доставки лекарств провинции Гуандун, Фармацевтический университет Гуандуна, Гуанчжоу, ⁴ Государственная ключевая лаборатория База выращивания, Ключевая лаборатория офтальмологии провинции Шаньдун, Шаньдунский глазной институт, Шаньдунская академия медицинских наук , ⁵ Глазная больница Циндао, Шаньдунский глазной институт, Шаньдунская академия медицинских наук, Циндао, Китай

Abstract: В качестве нового ионообменного носителя с большой площадью поверхности и отличной обменной способностью монтмориллонит (Mt) был интеркалирован гидрохлоридом бетаксолола (BH) с образованием нанокомпозита, а затем инкапсулирован липосомами (Mt-BH-LP) для получения нанокомпозита. офтальмологическая система доставки лекарств.Mt-BH и Mt-BH-LP были получены с помощью процесса подкисления и введения этанола в сочетании с методами градиента сульфата аммония. Успешное образование Mt-BH и Mt-BH-LP было подтверждено термогравиметрическим анализом, рентгеновской дифракцией, инфракрасными спектрами с преобразованием Фурье и просвечивающей электронной микроскопией. Mt-BH-LP обладали благоприятными физическими характеристиками эффективности инкапсуляции, нагрузки лекарственным средством, среднего размера частиц и ζ-потенциала. Исследования высвобождения in vitro показали, что Mt-BH-LP эффективно поддерживают относительно устойчивое медленное высвобождение.Иммортализованная цитотоксичность эпителиальных клеток роговицы человека, тесты на раздражение глаз у кроликов in vivo и окрашивание хориоаллантоисной мембраны трипановым синим показали, что Mt-BH-LP не вызывали явного раздражения глазных тканей. Новая модель оборота слезы in vitro, включающая вставки, содержащие эпителиальные клетки роговицы человека, была разработана для оценки времени удерживания Mt-BH-LP в прекорнеальном слое. Результаты показали, что Mt-BH-LP поддерживали определенную концентрацию BH в слезной жидкости в течение более длительного периода, чем раствор BH.Исследования прекорнеальной задержки in vivo также показали, что Mt-BH-LP продлевают задержку лекарственного средства на поверхности глаза больше, чем раствор BH. Кроме того, фармакодинамические исследования показали, что Mt-BH-LP оказывают пролонгированное действие на снижение внутриглазного оптического давления у кроликов. Наши результаты показали, что Mt-BH-LP обладают потенциалом в качестве офтальмологической системы доставки.

Ключевые слова: липосомы, монтмориллонит, раздражение, прекорнеальное время удержания, внутриглазное оптическое давление

Введение

Глаукома является наиболее распространенной причиной заболевания глаз и связана с повышением внутриглазного давления (ВГД), что в конечном итоге приводит к потере зрения. ^1,2 В течение последних нескольких десятилетий были предприняты большие усилия для улучшения действия обычных офтальмологических лекарственных форм для устранения этого глазного заболевания, но их широкому распространению в основном препятствовала нечеткость зрения. ³ Бетаксолола гидрохлорид (BH) использовался для лечения этой проблемы благодаря его превосходной способности селективно блокировать β ₁ -рецептор и кальциевые каналы. ⁴ Эти характеристики могут эффективно подавлять образование водянистой влаги и увеличивать ее выпот, что приводит к снижению ВГД и торможению прогрессирования заболевания.Однако применение БГ ограничено его крайне низкой биодоступностью и некоторыми побочными эффектами. Низкая биодоступность БГ обусловлена ​​в основном плохой проницаемостью роговицы для лекарственных средств. Таким образом, необходимо разработать новую систему местной доставки в глаза для BH, чтобы улучшить преокулярную задержку и абсорбцию лекарств. ⁵

В последние годы были разработаны различные офтальмологические системы доставки лекарств для глазных носителей, включая липосомы (LP), ^6–8 наночастицы, ^9,10 микросферы, ^11,12 наноструктурированные липидные носители, ^{13, 14} гели in situ, ^15,16 и контактные линзы. ¹⁷ Среди них LP в последнее десятилетие оказались многообещающими составами для глазного транспорта лекарств, поскольку они включают закрытые везикулы и двухслойные структуры. Эти структуры обладают многими благоприятными свойствами, включая хорошую биосовместимость, неиммуногенность и пролонгированное высвобождение. ^18,19 Кроме того, LP имеют подходящий размер частиц (PS) и ζ-потенциал (ZP), что может улучшить прекорнеальную способность удерживаться и поглощать лекарство. ²⁰ Таким образом, LP могут быть хорошими кандидатами для повышения глазной биодоступности препаратов для местного применения.

Монтмориллонит (Mt) — новый ионообменный носитель лекарств с большой площадью поверхности и отличной обменной способностью. ^21,22 В последние годы Mt, интеркалированный молекулами лекарств с различной структурой, вызвал большой интерес у исследователей, поскольку различные структуры демонстрируют улучшенные свойства высвобождения лекарств. Zheng et al. изучали интеркаляцию молекул ибупрофена в промежуточный слой Mt в качестве носителя лекарственного средства с замедленным высвобождением. ²³ Fejér et al. исследовали интеркаляцию и высвобождение хлорида прометазина и гидрохлорида буформина из Mt. ²⁴ Nunes et al. сообщили о загрузке и доставке сертралина с использованием Mt K10. ²⁵ Наше исследование также показало, что твердые липидные наночастицы ²² и наночастицы хитозана ²⁶ , интеркалированные с нанокомпозитами Mt-лекарство с образованием наноносителей, могут служить многообещающими глазными системами доставки лекарств.

В этом исследовании впервые BH интеркалировали с Mt, а затем инкапсулировали LP для создания нового наноносителя Mt-BH-LP, которые были получены путем подкисления Mt и введения этанола в сочетании с методами градиента сульфата аммония, соответственно. .Микроскопические характеристики Mt-BH-LP были измерены с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR), термогравиметрического анализа (TGA), рентгеновской дифракции (XRD) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM). Фармацевтическая оценка Mt-BH-LP была проведена впоследствии, включая эффективность инкапсуляции (EE), скорость загрузки лекарственного средства (DL), PS, ZP и поведение высвобождения лекарственного средства in vitro. Для оценки раздражения системы доставки лекарственного средства Mt-BH-LP применяли три различных теста, включая тест на цитотоксичность иммортализованных эпителиальных клеток роговицы человека (iHCEC), тест на раздражение глаз кролика in vivo и окрашивание хорионаллантоисной мембраны трипановым синим (CAM- ТБС).Наконец, также были исследованы фармакокинетика и фармакодинамика Mt-BH-LP, включая прекорнеальную задержку in vitro и in vivo и влияние этих офтальмологических составов на ВГД.

Материалы и методы

Материалы

Мт было получено от Aladdin Biochemical Technology (Шанхай, Китай). BH был приобретен у Hao Industrial (Цзинань, Китай). Фосфатидилхолин (ФХ) был получен от Taiwei Pharmaceutical (Шанхай, Китай). МТТ и все компоненты буферных растворов были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).Все остальные химические реагенты, использованные в исследовании, были высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или аналитической чистоты.

Получение Mt-BH и Mt-BH-LP

Mt-BH был получен на основе подкисления Mt при различных условиях реакции. ^22,27,28 Раствор BH (100 мл 3 мг·мл ^-1 ) и 100 мг кислоты-Mt смешивали в химическом стакане. После доведения pH дисперсии до 4 смесь оставляли статической для адсорбции на водяной бане при 50°C в течение 6 часов.Твердую и жидкую фазы разделяли центрифугированием, твердый Mt-BH сушили и затем хранили для дальнейшей обработки. Mt-BH-LP готовили путем введения этанола в сочетании с градиентом сульфата аммония. ^29,30 Вкратце, 225 мг ФХ, 25 мг холестерина и октадециламин помещали в 5 мл этанола в качестве масляной фазы при 60°С. В масляную фазу добавляли Mt-BH и обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут. Затем смесь медленно вводили в 10 мл 0,15 моль·л ^-1 сульфата аммония и перемешивали в течение 30 минут.После дальнейшего выпаривания органических растворителей полученный остаток добавляли к BH с самопроизвольным образованием Mt-BH-LP. BH-LP получали с помощью тех же стадий, но без добавления Mt-BH. Полученные BH-LP и Mt-BH-LP хранили при 4°C. Процесс приготовления Mt-BH-LP показан на рисунке 1.

Рисунок 1 Схема процесса приготовления Mt-BH-LP. Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид; Мт, монтмориллонит.

Эффективность захвата и скорость загрузки лекарством

EE и DL Mt-BH-LP были исследованы с помощью динамического диализа. ³¹ Свободный BH отделяли диализом с использованием диализного мешка с молекулярной массой 12–14 кДа. Дисперсии Mt-BH-LP (5 мл) переносили в диализные мешки, погружали в 100 мл растворяющей среды нормального физиологического раствора и затем перемешивали при 120 об/мин при 34°C. Концентрация препарата достигла баланса. Концентрацию BH в среде высвобождения определяли количественно с помощью ВЭЖХ.В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил-триметиламин (30:70, об:об) с рН 3 при скорости потока 1 мл·мин ^-1 . Определенные длина волны, температура колонки и вводимый объем составляли 275 нм, 25°C и 20 мкл соответственно. EE и DL Mt-BH-LP рассчитывали по следующим уравнениям:

		(1) 6

9 10007


(2)


(2)


(2)

6

₀ , C, M _BH и m _Mt–BH–LP – концентрация BH (мг·мл ⁻¹ ) Mt-BH-LP без диализной обработки, концентрация BH Mt-BH-LP в среде растворителя после диализной обработки, дозировка BH и масса Mt-BH-LP соответственно.

Характеристики

Для сбора спектрограмм использовался FTIR-спектрометр Vertex 70. Диапазон, разрешение и время сканирования составляли 400–4000 см ^-1 , 4 см ^-1 и 64 соответственно. TGA измеряли с помощью Netzsch STA 409 PC/PG, скорость нагрева и поток азота составляли 10°C·мин ^-1 и 60 см ³ ·мин ^-1 соответственно. Рентгенограммы определяли с использованием дифрактометра Bruker D8 advanced (излучение CuKα) от 3° до 70°, скорость сканирования, напряжение генератора и ток генератора составляли 3°·мин ^-1 , 40 кВ и 40 мА соответственно. .Морфологию Mt-BH-LP исследовали с помощью ПЭМ (Tecnai 10; Philips, Амстердам, Нидерланды) при ускоряющем напряжении 115 кВ. PS и ZP LP измеряли с помощью динамического светорассеяния и электрофоретического светорассеяния, соответственно, с использованием аппарата Бекмана.

Исследования стабильности

Mt-BH-LP (1 мл 2,8 мг·мл ^-1 ) смешивали с 10, 50 и 100 мл физиологического раствора, имитации слезной жидкости (STF) и фосфатно-солевого буфера соответственно. Исследования стабильности проводились при 34°C без света в трех экземплярах.Наблюдали изменения внешнего вида образцов, включая цвет, мутность и образование осадков. PS образца также измерялись через заданные интервалы времени.

Исследования высвобождения in vitro

Скорость высвобождения BH in vitro из Mt-BH-LP исследовали методом диализа. Дисперсии Mt-BH-LP (5 мл) помещали в диализный мешок и затем погружали в 100 мл высвобождающей среды STF при 34°C при 120 об/мин. Вкратце, 6,78 г NaCl, 2,18 г NaHCO ₃ , 0.084 г CaCl ₂ · 2H ₂ O и 1,38 г KCl растворяли в 1000 мл деионизированной воды для использования в качестве STF. Через заданные промежутки времени отбирали 5 мл высвобождающей среды и немедленно заменяли равным количеством свежей высвобождающей среды. Содержание BH в высвобождающей среде определяли с помощью ВЭЖХ. Каждый опыт повторялся пять раз. Данные исследований высвобождения in vitro были приспособлены к нескольким моделям высвобождения лекарственного средства, чтобы определить механизм высвобождения лекарственного средства из Mt-BH-LP.

Оценка раздражения

Цитотоксичность in vitro

iHCEC культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла DMEM/F12 вместе с 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 0,1 мг·мл ^-1 стрептомицина и 1000 МЕ·мл ^-1 пенициллина в Атмосфера 37°C, содержащая 5% CO ₂ . Цитотоксичность Mt-BH-LP in vitro оценивали в соответствии с анализом МТТ, который основан на митохондриальной конверсии соли тетразолия МТТ. ³² Приблизительно 10 ⁴ клеток/см ² высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 часов.Культуральную среду удаляли, а затем различные образцы (2,8 мг·мл ^-1 ) разного объема (10, 20, 30, 50, 80 и 100 мкл) с разным временем растворения (0,5, 2 и 4 часа). ) в модифицированной Дульбекко среде Игла/F12 добавляли к клеткам (100 мкл на лунку). После 24-часовой экспозиции культуральную среду удаляли, а клеточный субстрат промывали фосфатно-солевым буфером, после чего в каждую лунку добавляли по 180 мкл свежей среды и 20 мкл МТТ (5 мг·мл ^-1 ). Лечение 4 часа.По окончании опыта полученные гранулы формазана растворяли в диметилсульфоксиде. Жизнеспособность клеток измеряли спектрофотометрически при 490 нм по формуле:

(3)

где А ₁ и А _{0 9 контрольной группы и А 0 0 соответственно.}

Тест на раздражение глаз на кроликах in vivo

Все эксперименты на животных соответствовали требованиям Национального закона об экспериментальных животных (Китай) и были одобрены комитетом по этике животных Южного медицинского университета.Животные, используемые для всех экспериментов, представляли собой одну и ту же серию и весили 2-2,5 кг без каких-либо признаков воспаления или выраженных глазных аномалий (например, катаракты, глаукомы). Двенадцать здоровых новозеландских белых кроликов были отобраны для теста на раздражение глаз однократной дозой и разделены на четыре группы. В левые глаза каждой группы вводили 50 мкл физиологического раствора в качестве пустого контроля, а в правые глаза вводили 50 мкл образца в качестве контрольной группы. Глаза исследовали через 1, 2, 4, 24, 48 и 72 часа после введения, а раздражение оценивали в соответствии с рекомендациями Дрейза по проверке зрения. ³³ Тесты на долгосрочное раздражение глаз были такими же, как и тесты на раздражение глаз при однократном приеме, за исключением того, что введение продолжалось до 7 дней. После тестов на раздражение кроликов умерщвляли инъекцией воздуха. Глазные яблоки вырезали и фиксировали 10% формалином, а после окрашивания гематоксилином и эозином под микроскопом наблюдали гистопатологию роговицы и конъюнктивы.

Анализ окрашивания хорионаллантоисной мембраны трипановым синим

Вкратце, куриные яйца инкубировали в течение 9 дней и удаляли часть яичной скорлупы над воздушным пространством, обнажая САМ.Образец объемом 300 мкл наносили на САМ (дефектные яйца отбрасывали) и оставляли в контакте на 5 минут. Затем образец промывали нормальным физиологическим раствором и добавляли к САМ 0,5 мл раствора ТБ (1 мг·мл ^-1 ) на 1 минуту. Наконец, окрашенный САМ вырезали, а адсорбированный ТВ экстрагировали 1 мл формамида в течение 24 часов. Экстракт определяли УФ при 611 нм в пятикратной повторности. Обычный физиологический раствор и 0,1 моль·л ^-1 NaOH использовали в качестве групп отрицательного и положительного контроля соответственно.Поглощенное количество ТВ было пропорционально раздражению.

Прекорнеальная ретенция Mt-BH-LP

Прекорнеальное удержание Mt-BH-LP in vitro

В качестве модели использовали

слоя iHCEC. Перед культивированием в трансвелл заливали этанольный раствор коллагена из крысиного хвоста I типа (1,5 мг·мл ^-1 ), подкисленный уксусной кислотой, а затем водный раствор фибронектина (10 мкг·мл ^{— 1} ) проливали на фильтр с коллагеновым покрытием. После удаления раствора фибронектина нГЭК, диспергированные в культуральной среде, высевали на фильтр, и, когда нГЭК становились конфлюэнтными, индуцировали дифференцировку клеток и многослойный рост эпителия, поднимая конструкцию на поверхность раздела воздух-жидкость, чтобы иметь разный период глубинного культивирования.Прероговичное время удерживания Mt-BH-LP по сравнению с раствором оценивали с использованием аппарата для оборота слезы in vitro (рис. 2) и вставок, в которых культивировали ткань роговицы, в качестве камеры оборота. Затем вставки помещали в термостатирующую ванну при 34°С для поддержания температуры ТФ человека. Поступление и отток слез в камеру контролировали перистальтической помпой. Каждый эксперимент начинался с переноса 30 мкл образца (2,8 мг·мл ^-1 ) в оборотную камеру, предварительно заполненную 270 мкл СТФ.Каждые 10 минут 500 мкл собранного раствора и время удерживания в прекорнеальной области определяли с помощью ВЭЖХ с детектированием флуоресценции.

Рисунок 2 Схематическая диаграмма аппарата для оттока слезы in vitro. Примечания: Модель включала вставку, содержащую культивированную ткань роговицы, в качестве оборотной камеры; внешняя базальная сторона вкладыша была загерметизирована, чтобы избежать диффузии материала вниз. Температура системы поддерживалась при температуре слезной пленки человека (34°C).Постоянный приток и отток смоделированных слез в камеру контролировали перистальтические насосы. Сокращения: СТФ, имитация слезной жидкости; iHCEC, иммортализованная эпителиальная клетка роговицы человека.

Прекорнеальная ретенция Mt-BH-LP in vivo

Способность Mt-BH-LP к прекорнеальному удержанию оценивали с использованием метода удаления слез. ³⁴ Вкратце, шесть здоровых новозеландских белых кроликов были отобраны и разделены на группы с BH-раствором и Mt-BH-LP.Образцы (50 мкл) закапывали в конъюнктивальные мешки кроликов, а затем закрывали глаза на 1 минуту. Через заданные промежутки времени в конъюнктивальный мешок помещали бумагу размером 8×8 см для впитывания слез на 1 минуту. Δm бумаги принимали за массу абсорбированных слез. Каждый образец сушили и экстрагировали 200 мкл метанола, встряхивали в течение 5 минут и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант определяли с помощью ВЭЖХ и концентрации БГ в слезах по формуле:




(4) (4)

, где C ₀ , где C ₀ — концентрация препарата в слезах, C концентрацию препарата в метаноле, ρ плотность слез ( ρ = 1), а Δm вес слез.

Фармакодинамические исследования

Для фармакодинамических исследований in vivo использовали

новозеландских кролика-альбиноса массой 2–2,5 кг. Перед экспериментом кроликов содержали в темной комнате в течение 5 часов. ³⁵ ВГД измеряли с помощью инденторного тонометра (YZ7A; Suzhou Visual Technology Co Ltd, Сучжоу, Китай) под поверхностной анестезией (0,2% гидрохлорид лидокаина). Эти шесть кроликов были разделены на две группы: одной закапывали 50 мкл Mt-BH-LP в левый глаз, а другой закапывали равный раствор BH в левый глаз.Чтобы избежать смещения эксперимента, 50 мкл физиологического раствора помещали в конъюнктивальный мешок правого глаза (контроль) и оставляли открытым примерно на 1 минуту, чтобы предотвратить переливание глазных капель. ВГД всех глаз измеряли восемь раз через заданные интервалы времени (0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов). При каждом измерении получали три показания.

Результаты и обсуждение

Фармацевтическая оценка

Не было повышения концентрации лекарственного средства в течение 2 часов, что указывает на то, что свободные лекарственные средства полностью выводятся из организма и концентрация лекарственного средства достигает баланса через 2 часа (рис. 3).EE и DL Mt-BH-LP составляли 75,85% ± 2,15% и 11,41% ± 0,29% (n = 3) соответственно. Введение этанола в сочетании с градиентом сульфата аммония было эффективным и воспроизводимым. ФС имеет большое значение для воздействия на клеточное поглощение препаратов, вводимых местно. Предел PS для переносимости человеческим глазом составляет около 10 мкм, и, таким образом, носитель с меньшим PS демонстрирует лучшую способность пересекать биобарьер и лучше соблюдается пациентом. ³⁶ ZP — еще один ключевой фактор контроля стабильности офтальмологических систем доставки лекарств.Как показано на рисунке 4A, значения PS, ZP и индекса дисперсии полимера для BH-LP без включения Mt составляли 166,4 ± 1,89 нм, 19,33 ± 0,41 мВ и 0,155 ± 0,019 соответственно. После загрузки Mt в BH-LP средние значения PS, ZP и PDI для Mt-BH-LP составили 218 ± 22,32 нм, 17,03 ± 0,25 мВ и 0,191 ± 0,064 соответственно (рис. 4B). Это указывало на то, что загрузка Mt в BH-LP мало влияла на параметры PS и ZP, что было полезно для его применения в глазной системе доставки лекарств.Исследования стабильности показали, что никаких существенных изменений во внешнем виде или PS не наблюдалось.

Рисунок 3 Время достижения диализного равновесия Mt-BH-LP. Сокращение: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита-бетаксолола.

Рисунок 4 Примечание: Красная линия указывает кумулятивное распределение.Черная линия указывает процент размера частиц. f, дифференциальная интенсивность. Сокращение: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита-бетаксолола.

Морфологию Mt-BH-LP наблюдали с помощью графиков ПЭМ (рис. 5). BH-LP представляли собой однородные темные твердые сферы с приблизительным диаметром 130 нм (рис. 5B), что согласуется со значением, оцененным с помощью динамического анализа светорассеяния. Напротив, Mt-BH-LP демонстрировали четкую форму двухслойной везикулы с немного увеличивающимся диаметром примерно до 180 нм после инкапсуляции Mt-BH в LP (рис. 5D).В результате агрегации ЛП образовался двухслойный везикул.

Рисунок 5 TEM-изображения ( A , B ) BH-LP и ( C , D ) Mt-BH-LP. Примечание: ( B и D ) показывают увеличение красных квадратов в ( A и C ) соответственно. Сокращения: ПЭМ, просвечивающая электронная микроскопия; Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола.

Характерные пики 2θ (d ₀₀₁ ) кислот-Mt и Mt-BH составляли 5,5° и 4,8° с соответствующими базальными интервалами 1,54 нм и 1,93 нм соответственно (рис. 6). Увеличение значения d указывало на то, что молекулы BH были интеркалированы в межслоевое пространство Mt. ³⁷ Неожиданно, когда просто смешали кислоту-Mt и BH, смесь показала характерные пики, принадлежащие только кислоте-Mt или BH, без появления каких-либо новых пиков. Это означало, что процессы физического смешения не изменили расстояние между пластинками гибрида.Интересно, что характерные пики кислот-Mt и Mt-BH исчезли на кривой Mt-BH-LP из-за агрегации выстраивания цепей в LP после сшивания, что продемонстрировало успешное образование Mt-BH-LP. ³⁸

Рис. 6 ( A ) Рентгенограммы BH, кислот-Mt, Mt-BH, кислоты-Mt + BH BH-LP и Mt-BH-LP; ( B ) увеличенные рентгенограммы кислот-Mt и Mt-BH. Сокращения: XRD, рентгеновская дифракция; Mt-BH-LP, липосомы монтмориллонита-бетаксолола гидрохлорида; BH, бетаксолола гидрохлорид; Мт, монтмориллонит.

Кривые ТГА и дифференциальной сканирующей калориметрии использовались для дальнейшего объяснения новой химической связи этих гибридов. ^39,40 BH показал резкую потерю массы (около 95% масс.) при 240–450°C из-за полного разложения (рис. 7). Кислота-МТ показала небольшую потерю массы (около 8% масс.) при 120°С за счет испарения адсорбированной воды. По сравнению с кислотой-Mt, Mt-BH обладает небольшой потерей массы (около 9 мас. %) при 270–500 °C, что соответствует разложению BH, что говорит о том, что BH успешно внедряется в межслоевое пространство Mt. ⁴¹ Как Mt-BH-LP, так и BH-LP продемонстрировали очевидную потерю веса (около 67 мас.%) при 170°C–600°C из-за разложения LP. ⁴² Кроме того, по сравнению с BH-LP, Mt-BH-LP продемонстрировали характерную потерю веса (около 5 мас. %) при 700–1000 °C, что соответствует структурному повреждению Mt, что указывает на то, что Mt-BH был успешно инкапсулированные LP. ⁴³

Рисунок 7 ( A ) TGA и ( B ) ДСК картина BH, кислоты-Mt, Mt-BH, BH-LP и Mt-BH-LP. Сокращения: ТГА, термогравиметрический анализ; ДСК, дифференциальная сканирующая калориметрия; Mt-BH-LP, липосомы монтмориллонита-бетаксолола гидрохлорида; BH, бетаксолола гидрохлорид; Мт, монтмориллонит.

FTIR-спектры кислых Mt, BH, Mt-BH и Mt-BH-LP представлены на рис. 8. Поглощение при 3431, 1081 и 1041 см ⁻¹ принадлежало –OH, Si–O, и плоскостные валентные колебания Mt соответственно. ⁴⁴ В спектрах чистого BH поглощение при 3280, 1612 и 1512 см ⁻¹ приписывается валентным и деформационным колебаниям С–Н ароматического кольца и С–Н алкильной цепи.После внедрения BH в межслоевое пространство Mt в спектре Mt-BH исчезли характерные полосы (3280 и 2900–3100 см ^-1 ) BH, что свидетельствовало о сильном взаимодействии молекул BH с Mt. Кроме того, Mt-BH-LP показали широкий пик около 3100–3500 см ^-1 с исчезновением характерных полос (3622 см ^-1 ) из-за агрегации LP. ⁴⁶ Все эти вариации показали, что Mt-BH успешно встраивается в промежуточный слой LP.

Рис. 8 FTIR-спектры кислотных Mt, BH, Mt-BH и Mt-BH-LP. Сокращения: FTIR, инфракрасное преобразование Фурье; Mt-BH-LP, липосомы монтмориллонита-бетаксолола гидрохлорида; BH, бетаксолола гидрохлорид; Мт, монтмориллонит.

Исследования высвобождения in vitro

Для оценки высвобождающих свойств Mt-BH-LP были проведены эксперименты по высвобождению in vitro и проведены сравнения с BH-LP и раствором BH (рис. 9).Было обнаружено, что примерно 100% BH быстро высвобождается в течение 2,5 часов из образца BH, что свидетельствует о том, что BH может свободно диффундировать через диализную мембрану. По сравнению с раствором BH, BH-LP продемонстрировали высвобождение 50,3% в первые 2,5 часа, что привело к высвобождению 69,9% в течение 10 часов. Первоначальное взрывное высвобождение BH из BH-LP было ответственно за адсорбцию BH на поверхности LP. Кроме того, для Mt-BH-LP наблюдалось более медленное высвобождение только на 43,7% в исходных 2.5 часов по сравнению с BH-LP, после чего следует фаза замедленного высвобождения с гораздо более медленной скоростью высвобождения. Более медленная скорость высвобождения BH из Mt-BH-LP может быть приписана интеркаляции BH в межслоевое пространство Mt. Кроме того, характеристики ионообменных реакций и наличие электростатических взаимодействий между интеркалированным лекарственным средством и ионами щелочных металлов в буфере обусловливают относительно устойчивое медленное высвобождение. ⁴⁷

Рисунок 9 Кривые высвобождения in vitro раствора BH, BH-LP и Mt-BH-LP. Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Высвобождение лекарственного средства из имитационных моделей показало, что профили высвобождения лекарственного средства Mt-BH-LP in vitro согласуются как с уравнением Вейбулла ( r =0,9988), так и с уравнением кинетики первого порядка ( r = 0,9913). Это указывало на то, что высвобождение BH контролировалось диффузией, а также механизмами эрозии матрицы из Mt-BH-LP с подходящей скоростью. ⁴⁸

Оценка раздражения

Цитотоксичность in vitro

Жизнеспособность iHCECs после воздействия Betoptic, раствора BH, пустых LP и Mt-BH-LP в различных количествах в течение 0,5, 2 и 4 часов показана на рисунке 10. Эти результаты показали, что цитотоксичность каждого образца для клеток была зависит от суммы. Как показано на рисунке 10А, жизнеспособность клеток с Betoptic была самой низкой среди образцов. В целом жизнеспособность клеток составляла менее 60%, когда объем введения Бетоптика составлял всего 10 мкл.Жизнеспособность клеток резко падала ниже 20%, когда объем введения превышал 20 мкл. Высокая цитотоксичность Betoptic может быть связана с его большей вязкостью и электроположительностью. Напротив, жизнеспособность iHCEC, обработанных 10, 20 и 30 мкл BH, пустых LP и Mt-BH-LP соответственно, была очень высокой (> 70%), и не наблюдалось очевидной разницы в выживаемости клеток. среди этих образцов. Хотя значения жизнеспособности показали значительное снижение, когда количество превышало 100 мкл, холостой LP и экспозиция Mt-BH-LP показали более высокую жизнеспособность iHCEC по сравнению с BH.Это можно объяснить тем, что Mt-BH-LP могут защищать клетки от повреждения BH (лекарственное сырье). На рисунке 11 показана токсичность Betoptic, BH, пустых LP и Mt-BH-LP на iHCEC в каждом количестве (10, 20, 30, 50, 80, 100 мкл) в течение 2 часов при Betoptic > BH > Mt-BH-. LP > пустые LP. Из этих результатов становится ясно, что Mt-BH-LP могут эффективно поддерживать превосходную жизнеспособность клеток в соответствующем диапазоне.

Рисунок 10 . Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Рис. 11 Жизнеспособность iHCEC при воздействии различных количеств Betoptic, раствора BH, пустых LP и Mt-BH-LP в течение 2 часов. Сокращения: iHCECs, иммортализованные эпителиальные клетки роговицы человека; Mt-BH-LP, липосомы монтмориллонита-бетаксолола гидрохлорида; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Тест на раздражение глаз на кроликах in vivo

Раздражение глаз препаратами BH и Mt-BH-LP оценивали по методу Дрейза с использованием физиологического раствора и препаратов Betoptic в качестве контрольного эксперимента. Показатели роговицы и радужной оболочки для всех составов были нулевыми (таблица 1). Несмотря на то, что при применении препаратов BH и Mt-BH-LP в глазах наблюдалась гиперемия конъюнктивы, существенных различий по сравнению с обычным физиологическим раствором и Betoptic не наблюдалось. Эта конъюнктивальная гиперемия была ответственна за чувствительность конъюнктивы к экзогенным соединениям.Суммарные баллы составили 0–3 для всех составов в однократных дозах или длительных экспериментах по раздражению глаз. Эти оценки показали, что Mt-BH-LP не проявляли признаков раздражающего действия на глазные ткани в глазах кроликов и даже меньше раздражали, чем BH и коммерческий Betoptic.

Таблица 1 Результаты теста Дрейза Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита-бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Гистологический анализ срезов роговицы различных составов после испытаний на длительное раздражение показан на рисунке 12.На рисунке 12А нормальная роговица демонстрирует гладкую и четкую структуру ткани. Удовлетворительная структура эпителия и стромы с небольшим отеком сохранялась после введения физиологического раствора (рис. 12В). Однако после обработки Betoptic поверхностные эпителиальные клетки были повреждены и наблюдались некоторые просветы на поверхности роговицы (рис. 12C). После введения BH наблюдалось легкое воспаление в эпителиальных клетках роговицы (фиг. 12D). Кроме того, в глазах, обработанных Mt-BH-LP, эпителиальные клетки роговицы демонстрировали некоторый небольшой отек после испытаний на длительное раздражение (фиг. 12E).На рис. 13 представлена ​​иммуногистохимия конъюнктивы после длительных тестов на раздражение различными составами. Конъюнктива, обработанная физиологическим раствором (фиг. 13В), показала легкое воспаление с выпуклостью на клеточной поверхности по сравнению с нормальной конъюнктивой (фиг. 13А). Кроме того, конъюнктива, получавшая Betoptic и BH, также демонстрировала хроническое воспаление, что подтверждается появлением некоторой гиперемии и клеточного повреждения (фиг. 13C и D). В группе Mt-BH-LP (фиг. 13E) конъюнктива показала небольшую инфильтрацию лимфоцитов без явного воспаления.Гистологический анализ показал, что в роговице и конъюнктиве не было обнаружено клеточной инфильтрации, кровоизлияния или некроза после обработки Mt-BH-LP, что указывает на то, что Mt-BH-LP обладали меньшей токсичностью для конъюнктивы и роговицы, чем раствор BH и Betoptic после длительного применения. тесты на раздражение.

Рисунок 12 Гистопатология роговицы с помощью микроскопии. Примечания: ( A ) Нормальная роговица, ( B ) обработанная физиологическим раствором, ( C ) обработанная Betoptic, ( D ) обработанная раствором BH и ( E ) обработанная Mt -BH-LP. Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Рисунок 13 Гистопатология конъюнктивы при микроскопии. Примечания: ( A ) Нормальная роговица, ( B ) обработанная физиологическим раствором, ( C ) обработанная Betoptic, ( D ) обработанная раствором BH и ( E ) обработанная Mt -BH-LP. Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид.

САМ-ТБС

Для изучения макроскопических изменений в САМ, таких как гиперемия, кровоизлияние и коагуляция, после обработки испытуемыми веществами применяли метод теста куриных яиц-САМ (HET-CAM) (рис. 14А). В предыдущей работе сообщалось, что тест HET-CAM не полностью репрезентативен для раздражения глаз. ^49,50 Таким образом, метод CAM-TBS был разработан, чтобы предложить стратегию объективной оценки для преодоления недостатков отсутствия объективности и количественности, возникающих в результате метода HET-CAM. ⁵¹ Этот метод CAM-TBS был разработан для оценки негативного воздействия веществ путем измерения количества ТБ, адсорбированного с помощью CAM в качестве конечной точки анализа. TBS широко применяется для измерения жизнеспособности клеток и обнаружения разрушения и денатурации мембраны. Поглощение ТБ было в следующем порядке: NaOH (положительный контроль) > BH > Betoptic > Mt-BH-LPs > физиологический раствор (NS) (отрицательный контроль) (фиг. 14B). Эти результаты согласуются со значениями, полученными с помощью теста Дрейза, который показал, что Mt-BH-LP безопасны для доставки лекарств в глаза.

Рис. 14 Сокращения: NS, физиологический раствор; Mt-BH-LP, липосомы монтмориллонита-бетаксолола гидрохлорида; BH, бетаксолола гидрохлорид; САМ, хориоаллантоисная мембрана.

Прекорнеальная ретенция Mt-BH-LP

Прекорнеальное удержание Mt-BH-LP in vitro

Гистологически конструкция выглядит как многослойный эпителий и может иметь сходство с нормальным эпителием роговицы человека (рис. 15).Модели клеточных культур глазных барьеров могут предоставить мощные системы для исследования фармакокинетических свойств Mt-BH-LP. Существует гипотеза, что объем ТФ человека составляет 7 мкл, а скорость слезопродукции 1,3 мкл·мин ^-1 , поэтому мы увеличили эти параметры в 38 раз, поместив 270 мкл СТФ в оборотную камеру и зафиксировав 50 мкл·мин ⁻¹ слезный поток. ⁵² Время пребывания на компартменте эпителия роговицы/TF после применения Mt-BH-LP в сравнении с раствором BH показано на рисунке 16.Самая высокая концентрация BH (около 38,87 мкг·мл ^-1 ) наблюдалась сразу после нанесения BH и быстро снижалась до неопределяемых значений менее чем за 60 минут. Для Mt-BH-LP наблюдалось увеличение концентрации BH с последующим почти плато и последующим снижением. Концентрации BH достигли неопределяемых значений более чем через 110 минут. Эти данные свидетельствуют о том, что Mt-BH-LP сохраняют концентрацию лекарственного средства в водянистой влаге в течение более длительного времени, чем BH.

Рисунок 15 Замороженный срез стратифицированных иммортализованных эпителиальных клеток роговицы человека. Примечание: Изображение с флуоресцентного микроскопа (увеличение 400×).

Рис. 16 Кривая зависимости концентрации от времени в компартменте роговица/слезная пленка после местного применения раствора BH и Mt-BH-LP. Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Прекорнеальная ретенция Mt-BH-LP in vivo

Фармакокинетические параметры (таблица 2) оценивали с использованием фармакокинетической программы: 3p87, разработанной Математически-фармакологическим комитетом Китайской академии фармакологии.Период полураспада, среднее время пребывания и площадь под кривой Mt-BH-LP были в 15,7, 2,6 и 4,8 раза больше, чем у раствора BH соответственно. На рис. 17 показана концентрация BH в слезах кроликов в зависимости от времени. Хотя общая тенденция кривых зависимости двух составов от времени была сходной, концентрация BH в Mt-BH-LP была выше, чем в растворе BH в каждый момент времени. Для раствора BH концентрация BH в слезах быстро упала примерно с 400 мкг·мл ^-1 за 5 минут до 18 мкг·мл ^-1 за 30 минут.По сравнению с раствором BH концентрации BH Mt-BH-LP в слезах были выше (примерно в три раза), чем в растворе BH в те же промежутки времени. Интересно, что концентрация BH 13,6 мкг·мл ^-1 в Mt-BH-LP была обнаружена даже через 240 минут. Это указывало на то, что Mt-BH-LP могут оставаться в области роговицы, что согласуется с результатами, полученными в фармакокинетических исследованиях in vitro. Эти результаты показали, что Mt-BH-LP могут продлевать время удержания лекарств на поверхности глаза и замедлять выведение лекарств, тем самым повышая биодоступность глазных офтальмологических препаратов для местного применения.

Таблица 2 Фармакокинетические параметры BH в слезах после местного применения кроликам Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы монтмориллонита-бетаксолола гидрохлорида; BH, бетаксолола гидрохлорид; t ½ , период полураспада; MRT, среднее время пребывания; AUC, площадь под кривой.

Рисунок 17 Кривая зависимости средней концентрации слезной жидкости от времени после местного применения раствора BH и Mt-BH-LP в глазах кролика. Сокращения: Mt-BH-LP, липосомы гидрохлорида монтмориллонита и бетаксолола; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Фармакодинамические исследования

На рис. 18 показаны изменения ВГД у кроликов для трех групп (физиологический раствор, BH и Mt-BH-LP) для определения терапевтической эффективности. В целом ВГД повышали у кроликов, помещая их в темную комнату. ³² ВГД повысилось на 4–5,5 мм рт. ст. по сравнению с нелеченными кроликами (15,03 мм рт. ст.) после 5 часов пребывания в темноте.Это повышенное ВГД обычно сохранялось не менее 8 часов в темноте. Из рисунка 18 видно, что как BH, так и Mt-BH-LP явно препятствовали повышению ВГД по сравнению с обычным физиологическим раствором. Интересно, что снижение ВГД для Mt-BH-LP было больше, чем для BH. Из кривой видно, что ВГД ЧД даже значительно снизилось на 24% через 1 час, но быстро вернулось к исходным значениям через 6 часов (20,14 мм рт.ст.). Наоборот, Mt-BH-LP показали небольшое снижение ВГД до 22.4% через 2 часа, а затем медленно повышается до 19,45 мм рт.ст. ниже исходных значений через 6 часов. Это означает, что новый препарат Mt-BH-LP эффективно продлевает эффект снижения ВГД после введения.

Рисунок 18 Изменение ВГД у кроликов с физиологическим раствором, раствором BH и Mt-BH-LP. Сокращения: ВГД, внутриглазное давление; Mt-BH-LP, липосомы монтмориллонита-бетаксолола гидрохлорида; BH, бетаксолола гидрохлорид.

Заключение

Таким образом, была разработана новая ионообменная система доставки лекарств на основе нанокомпозита Mt-BH, включенного в LP (Mt-BH-LP). Mt-BH и Mt-BH-LP получали путем подкисления и введения этанола в сочетании с градиентом сульфата аммония. Данные TGA, XRD, FTIR и TEM продемонстрировали успешное формирование нанокомпозита Mt-BH и состава Mt-BH-LP. Предполагалось, что Mt-BH-LP имеют небольшой PS и демонстрируют замедленное высвобождение, что оценивается по динамическому светорассеянию и высвобождению in vitro соответственно.МТТ, CAM-TBS и тесты на раздражение глаз на кроликах in vivo показали, что Mt-BH-LP не вызывают явного раздражения и относительно безопасны для офтальмологической доставки. Как in vitro, так и in vivo прекорнеальное удержание Mt-BH-LP показало, что они могут увеличивать время пребывания BH в прекорнеале и уменьшать прекорнеальную потерю лекарственного средства. Следовательно, Mt-BH-LP могут снижать ВГД более эффективно, чем раствор BH. Из вышеупомянутых результатов было продемонстрировано, что Mt-BH-LP являются потенциальными кандидатами для доставки лекарств в глаза.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант 51102052) и Фонда медицинских научных исследований провинции Гуандун, Китай (грант A2016275). Глазной институт провинции Шаньдун получил признание за предоставление iHCEC. Это исследование было одобрено Этическим комитетом Шаньдунского офтальмологического института, и все эксперименты проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

---

Каталожные номера

1.		Каприоли Дж., Коулман А.Л. Колебания внутриглазного давления как фактор риска прогрессирования поля зрения при низком внутриглазном давлении в исследовании вмешательства на поздних стадиях глаукомы. Офтальмология . 2008;115(7):1123–1129.
2.		Jung HJ, Abou-Jaoude M, Carbia BE, Plummer C, Chauhan A. Терапия глаукомы путем пролонгированного высвобождения тимолола из силикон-гидрогелевых контактных линз, наполненных наночастицами. J Разблокировка управления . 2013;165(1):82–89.
3.		Галларате М., Кирио Д., Буссано Р. и др. Разработка наноэмульсий типа М/В для офтальмологического применения тимолола. Int J Фарм . 2013;440(2):126–134.
4.		Huang W, Zhang N, Hua H, et al. Получение, фармакокинетика и фармакодинамика офтальмологического термочувствительного in situ гидрогеля бетаксолола гидрохлорида. Биомед Фармакотер . 2016;83:107–113.
5.		Дэвис Н.М. Биофармацевтические соображения при местной доставке лекарств в глаза. Clin Exp Pharmacol Physiol . 2000;27(7):558–562.
6.		. проникновение роговицы. Int J Наномедицина . 2013; 8: 1921–1933.
7.		Четони П., Монти Д., Тампуччи С. и др. Липосомы как потенциальная система доставки дистамицина А в глаза. Int J Pharm . 2015; 492(1–2):120–126.
8.		Zhang J, Liang X, Li X, et al. Окулярная доставка цианидин-3-гликозида в липосомах и предотвращение окислительного стресса, вызванного селенитом. Drug Dev Ind Pharm . 2016;42(4):546–553.
9.		Aksungur P, Demirbilek M, Denkbaş EB, Vandervoort J, Ludwig A, Unlü N. исследования. J Разблокировка управления . 2011;151(3):286–294.
10.		Даксфилд Л., Султана Р., Ван Р. и др.Разработка нагруженных гатифлоксацином катионных полимерных наночастиц для доставки лекарств в глаза. Фарм Дев Тех . 2015;21(2):172–179.
11.		Андрес-Герреро В., Зонг М., Рамзи Э. и др. Новые биоразлагаемые полиэфирамидные микросферы для контролируемой доставки лекарств в офтальмологии. J Разблокировка управления . 2015; 211:105–117.
12.		Osswald CR, Kang-Mieler JJ.Контролируемое и пролонгированное высвобождение модельного белка из системы доставки лекарств микросфера-гидрогель. Энн Биомед Инж . 2015;43(11):2609–2617.
13.		Hippalgaonkar K, Adelli GR, Hippalgaonkar K, Repka MA, Majumdar S. Нагруженные индометацином твердые липидные наночастицы для доставки в глаза: разработка, характеристика и оценка in vitro. J Ocul Pharmacol Ther . 2013;29(2):216–228.
14.		Leonardi A, Bucolo C, Drago F, Salomone S, Pignatello R. Катионные твердые липидные наночастицы усиливают глазной гипотензивный эффект мелатонина у кроликов. Int J Фарм . 2015;478(1):180–186.
15.		Хорват Г., Гьярмати Б., Берко С. и др. Тиолированная поли(аспарагиновая кислота) как потенциальная гелеобразующая in situ, глазная мукоадгезивная система доставки лекарств. Евро Дж Фарм Сци . 2015; 67:1–11.
16.		У И, Яо Дж, Чжоу Дж, Дахмани ФЗ. Усиленная и устойчивая местная доставка циклоспорина А в глаза в термочувствительных микрогелях на основе гиалуроновой кислоты, образующих in situ. Int J Наномедицина . 2013;8:3587–3601.
17.		Маулви Ф.А., Лакдавала Д.Х., Шейх А.А. и др. In vitro и in vivo оценка новой технологии имплантации гидрогелевых контактных линз для контролируемой доставки лекарств. J Разблокировка управления .2016; 226:47–56.
18.		Лаюнен Т., Хисазуми К., Канадзава Т. и др. Местная доставка лекарственного средства к пигментному эпителию сетчатки с помощью микрофлюидизатора продуцировала небольшие липосомы. Евро Дж Фарм Сци . 2014;62:23–32.
19.		Shafaa MW, Sabra NM, Fouad RA. Пролонгированный глазной гипотензивный эффект тимолола малеата, связанного с липосомальным холестерином, у кроликов с глаукомой. Биофарм Лекарственные препараты . 2011;32(9):507–517.
20.		Асасутджарит Р., Терачаянан Т., Кевсуван П., Виранодха С., Фуонгфучат А., Риттидей Г.К. Разработка и оценка наночастиц N-триметилхитозана, загруженных диклофенаком натрия, для офтальмологического применения. AAPS Pharm Sci Tech . 2015;16(5):1013–1024.
21.		Агуцци К., Сересо П., Визерас К., Карамелла К.Использование глин в качестве систем доставки лекарств: возможности и ограничения. Appl Clay Sci . 2007;36(1–3):22–36.
22.		Hou DZ, Hu S, Huang Y, et al. Получение и исследование in vitro липидных наночастиц, инкапсулирующих монтмориллонит с лекарственным средством, для доставки в глаза. Appl Clay Sci . 2016;119(2):277–283.
23.		Чжэн Дж.П., Луан Л., Ван Х.И., Си Л.Ф., Яо К.Д.Исследование интеркаляционных композитов ибупрофена/монтмориллонита в качестве системы высвобождения лекарственного средства. Appl Clay Sci . 2007;36(4):297–301.
24.		Фейер И., Ката М., Эрос И., Беркеши О., Декани И. Высвобождение катионных препаратов из загруженных глинистых минералов. Коллоидный полимер Sci . 2001;279(12):1177–1182.
25.		Nunes CD, Vaz PD, Fernandes AC, Ferreira P, Romão CC, Calhorda MJ.Загрузка и доставка сертралина с использованием неорганических микро- и мезопористых материалов. Евро J Pharm Биофарм . 2007;66(3):357–365.
26.		Хоу Д.З., Гуй Р.Ю., Ху С., Хуан И., Цзуйонг Фэн З.Ю., Пин К.Н. Подготовка и характеристика новых хитозановых носителей с монтмориллонитом, вставленным лекарственным средством, для доставки лекарств в глаза. Адв Нанопарт . 2015;4(3):70–84.
27.		Кевадия Б.Д., Джоши Г.В., Моди Х.М., Баджадж Х.К.Композиты гидрогеля биополимер-глина в качестве носителя лекарств: интеркаляция хозяин-гость и исследование высвобождения гидрохлорида лидокаина in vitro. Appl Clay Sci . 2011;52(4):364–367.
28.		Джоши Г.В., Кевадия Б.Д., Патель Х.А., Баджадж Х.К., Ясра Р.В. Монтмориллонит как система доставки лекарств: интеркаляция и высвобождение малеата тимолола in vitro. Int J Фарм . 2009;374(1–2):53–57.
29.		Ганди Р., Хатри Н., Барадиа Д., Вхора И., Мишра А. Липосомы эпирубицин-HCl с модифицированной поверхностью и их оценка in vitro в клеточной линии рака молочной железы: MCF-7. Наркотик Делив . 2016;23(4):1152–1162.
30.		Yu Y, Lu Y, Bo R, et al. Получение липосом гипенозидов и их влияние на перитонеальные макрофаги функционируют in vitro. Int J Фарм . 2014; 460(1–2):248–254.
31.		Vega E, Egea MA, Calpena AC, et al. Роль гидроксипропил-β-циклодекстрина в лиофилизированных и гамма-облученных наносферах диблок-сополимера PLGA и PLGA-PEG для доставки офтальмологического флурбипрофена. Int J Наномедицина . 2012;7:1357–1371.
32.		Gokce EH, Sandri G, Bonferoni MC, et al. Нагруженные циклоспорином А СЛУ: оценка клеточного поглощения и цитотоксичности роговицы. Int J Фарм .2008;364(1):76–86.
33.		Буда И., Будай П., Сабо Р., Лехель Дж. Изучение коррозии глаз агрохимикатов in vitro на изолированном курином глазу. Commun Agric Appl Biol Sci . 2013;78(2):177–181.
34.		Li J, Liu H, Liu LL, Cai CN, Xin HX, Liu W. Дизайн и оценка бринзоламидной лекарственной смолы на месте термочувствительной гелеобразующей системы для устойчивой офтальмологической доставки лекарств. Chem Pharm Bull (Токио) . 2014;62(10):1000–1008.
35.		Nagai N, Yoshioka C, Mano Y, et al. Наночастицы дисульфирама продлевают время пребывания препарата в роговице и снижают внутриглазное давление. Exp Eye Res . 2015; 132:115–123.
36.		Zhang W, Li X, Ye T, et al. Дизайн, характеристика, ингибирование и поглощение клеток in vitro оптимизированных НЖК, нагруженных генистеином, для предотвращения помутнения задней капсулы с использованием методологии поверхности ответа. Int J Фарм . 2013;454(1):354–366.
37.		Джоши Г.В., Кевадия Б.Д., Баджадж Х.К. Состав с контролируемым высвобождением ранитидинсодержащего монтмориллонита и Eudragit E-100. Drug Dev Ind Pharm . 2010;36(9):1046–1053.
38.		Чиу К.В., Чу К.С., Ченг В.Т., Лин Дж.Дж. Расслоение смектитовых глин разветвленными полиаминами, состоящими из множества ионных участков. Евро Полим J . 2008;44(3):628–636.
39.		Кевадия Б.Д., Thumbar RP, Rajput MM, et al. Композиты монтмориллонит/поли(ε-капролактон) как универсальный слоистый материал: резервуары для противораковых препаратов и свойство контролируемого высвобождения. Евро Дж Фарм Сци . 2012;47(1):265–272.
40.		Кевадия Б.Д., Патель Т.А., Джала Д.Д., и др. Слоистые неорганические нанокомпозиты: перспективный носитель 5-фторурацила (5-ФУ). Евро J Pharm Биофарм . 2012;81(1):91–101.
41.		Кевадия Б.Д., Четтиар С.С., Раджкумар С., Баджадж Х.К., Госаи К.А., Брахмбхатт Х. Оценка глины/поли (l-лактида) микрокомпозитов в качестве противоракового препарата, цитотоксичность in vitro, маркеры окислительного стресса и фармакокинетика in vivo. Коллоиды Surf B Биоинтерфейсы . 2013; 112:400–407.
42.		Цай К.С., Джуанг Т.И., Дай С.А. и др. Синтез и интеркалированное монтмориллонитом поведение дендритных поверхностно-активных веществ. J Mater Chem . 2006;16(21):2056–2063.
43.		Li SL, Jiang CX, Chen XM, Wang H, Lin J. Lactobacillus casei , иммобилизованные на монтмориллоните: выживаемость в симулированных условиях рефрижерации и желудочно-кишечного тракта. Food Res Int . 2014; 64: 822–830.
44.		Кевадия Б.Д., Джоши Г.В., Патель Х.А., Инголе П.Г., Моди Х.М., Баджадж Х.К. Монтмориллонит-альгинатные нанокомпозиты как система доставки лекарств: интеркаляция и высвобождение in vitro витаминов B1 и B6. J Биоматер Приложение . 2010;25(2):161–177.
45.		Кевадия Б.Д., Джоши Г.В., Баджадж Х.К. Слоистые бионанокомпозиты как носитель прокаинамида. Int J Фарм .2010;388(1–2):280–286.
46.		Илиеску Р.И., Андронеску Э., Гитулика К.Д., Войку Г., Фикай А., Хотетеу М. Монтмориллонит-альгинатный нанокомпозит как система доставки лекарств: включение и высвобождение in vitro. Int J Фарм . 2014;463(2):184–192.
47.		Кевадия Б.Д., Раджкумар С., Баджадж Х.К., и др. Биоразлагаемые композитные гидрогели желатин-ципрофлоксацин-монтмориллонит для контролируемого высвобождения лекарственных средств и наложения повязок на раны. Коллоиды Surf B Биоинтерфейсы . 2014; 122:175–183.
48.		Каунисто Э., Таджароби Ф., Абрамсен-Алами С., Ларссон А., Нильссон Б., Аксельсон А. Механистическое моделирование высвобождения лекарств из полимерной матрицы с использованием магнитно-резонансной микровизуализации. Евро Дж Фарм Сци . 2013;48(4–5):698–708.
49.		Лоуренс Р.С., Акройд Д.М., Уильямс Д.Л. Хориоаллантоисная мембрана в прогнозировании потенциала раздражения глаз. Токсикол In Vitro . 1990;4(6):321–323.
50.		Reinhardt CA, Pelli DA, Zbinden G. Интерпретация данных клеточной токсичности для оценки потенциального раздражения. Food Chem Toxicol . 1985;23(2):247–252.
51.		Хагино С., Итагаки Х., Като С., Кобаяши Т. Дальнейшая оценка количественного теста хориоаллантоисной мембраны с использованием окрашивания трипановым синим для прогнозирования раздражения глаз химическими веществами. Токсикол In Vitro . 1993;7(1):35–39.
52.		Джаннола Л.И., де Каро В., Джандалия Г., Сирагуса М.Г., Кордон Л. Глазные гелеобразующие микросферы: время удерживания в прекорнеальной области in vitro и проникновение лекарственного средства через восстановленный эпителий роговицы. No related posts. Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт