Содержание

БЕЛАК F — однокомпонентный фторирующий лак — Инструкция


Белак F — однокомпонентный фторирующий лак.

Применяется для профилактики кариеса зубов у детей и подростков, а также как лечебное средство при гиперестезии зубов, при клиновидных дефектах, травматических повреждениях эмали и других некариозных поражениях.

Стоматологический материал Белак F выпускается в двух формах:

  • Белый
  • Прозрачный

Нельзя допускать попадания препарата на слизистую.

Основные свойства

Белый однокомпонентный. В его состав входят растворитель, пленкообразователь, калий фтористый.

Ионы фтора, содержащиеся в препарате, укрепляют эмаль зубов, снижают ее проницаемость, предохраняют зубы от развития кариеса.

Прозрачный. В его состав входят природный пленкообразователь, соединение фтора нового поколения (аминофторид), антисептический компонент и растворитель. Ионы фтора, содержащиеся в препарате, укрепляют эмаль зубов, снижают ее проницаемость, предохраняют зубы от развития кариеса.

Белак F — инструкция

После удаления зубного налёта поверхность зубов протирают ватным тампоном, изолируют зубы при помощи ватных валиков, просушивают воздухом. Затем с помощью аппликатора наносят лак на поверхность зубов и просушивают воздушным потоком 4-5 минут. Образовавшаяся плёнка сохраняется на зубах 10-12 часов. 

Внимание! С целью предотвращения повреждения эмали нельзя чистиь зубы и принимать твёрдую пищу в течение 12 часов. Плёнка легко удаляется зубной щёткой.

Для профилакти кариеса у школьников покрывают лаком все зубы: при I степени активного кариеса — 2 раза в год, при II степени — 4 раза в год, при III — 6 раз в год. В качестве лечебного средства материал применяют курсом до 4-х аппликаций с интервалом в 3 дня.

Форма выпуска: флакон 25 мл.

Вывод. Для тех, у кого зубы чувствительные, Белак F может стать просто спасением, особенно, если делать аппликации курсами и регулярно, например, два раза в год. Стоит препарат совсем недорого, а учитывая, что расходуется он очень экономно, получается, что одна процедура стоит копейки.

Михаил Багрич04.01.2017

Оценка статьи Загрузка…

Понравилась статья?
Поделитесь:

Вам может быть интересно

07/01/2017

Глуфторэд — стоматологический комплект для глубокого фторирования эмали и дентина. Применяется для глубокого фторирования эмали и дентина при: Профилактике и…

27/01/2018

Метапаста —  гидроокись кальция с сульфатом бария. Применение:  открытая пульпа в пульпарной прокладке и при пульпотомии. Неплотный канал. Апексификация. Формирование твердотканевого барьера (вторичный…

25/01/2016

Абсцесс Ремеди — бактерицидный, рентгенконтрастный препарат для дезинфекции корневых каналов. Показания: лечение инфицированного кариеса 4 степени, асептического некроза пульпы. Временное…

Фторирующий лак для зубов Владмива БЕЛАК-F Стоматологический противокариесный — «Очень помогает при чувствительности зубов, но пользоваться довольно трудно»

Белак-F — это практически тот же самый фторлак, которым в стоматологических поликлиниках нам смазывали зубы в детстве. В его состав входит соединение фтора нового поколения аминофторид и антисептик. А в составе фторлака — натрия фторид и пихтовый бальзам. Так что Белак-F — это усовершенствованный фторлак. После нанесения он образует пленку, которая насыщает эмаль зубов ионами фтора.

Я купила Белак-F из-за чувствительности зубов, у меня начали появляться клиновидные дефекты передних зубов (оголились шейки клыков). Была сильная боль, не могла есть кислые фрукты.

Белак-F в аптеке я не нашла, обратилась в магазин профессиональной мед.техники. В продаже был прозрачный и желтый лак, я выбрала прозрачный. В бутыльке 25мл, но хватает надолго. Прилагаются так же палочки-аппликаторы.

Наносить Белак-F нужно на сухую поверхность зуба (я сушу феном), после нанесения опять же высушить, пока не образуется пленка. Пленка прозрачная, на зубах совсем незаметно. Оставить пленку на 12 часов, то есть на ночь, а утром ее легко удалить щеткой даже без пасты.

Эффект от применения, несомненно, есть. Причем уже после первого применения. Конечно, визуально мои клиновидные дефекты не зацементировались, но чувствительность была снята на раз и пока не возвратилась (прошло месяца три). Чтобы добиться лучшего эффекта процедуру лучше повторить в течении нескольких дней. Передние зубы, обработанные Белак-F выглядят немного более белыми.

Минусы препарата: неудобно наносить. Когда это делает дантист — никаких проблем, все обложено ватными тампонами, высушено струей воздуха.. Дома же, пока зубы перед нанесением высушишь, вся истечешь слюнями, влажные губы прикасаются у зубам, да и больно — без слюны чувствительность ух какая. Потом опять нужно пленку высушить, опять слюни и боль.

Теперь-то я немного приноровилась — наношу в четыре этапа: сначала верхие зубы справа обрабатываю полностью (сушу, покрываю лаком, сушу). Потом слева. Потом нижние так же. Долго по времени получается, зато у меня все под контролем.

Вывод. Для тех, у кого зубы чувствительные, Белак-F может стать просто спасением, особенно, если делать аппликации курсами и регулярно, например, два раза в год. Стоит препарат совсем недорого, а учитывая, что расходуется он очень экономно, получается, что одна процедура стоит копейки. А в платных стомат.поликлиниках за эту процедуру берут приличные деньги.

Кстати, желтый лак тоже имеет преимущества — сразу видно где он был нанесен, а где нет. С прозрачным порой трудно это понять.

Спасибо за внимание!

На право поставки материалов стоматологических для нужд КГБУЗ «Ужурская РБ»

Наименование Кол-во Цена за ед. Стоимость, ₽

Паста для временного пломбирования или для компресса лечебно-защитного прилокальной форме пародонтита «Парасепт»: защитный компресс (60гр) ВладМива

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

235,02

235,02

Гель для комплексного лечения и профилактики заболеваний пародонта.

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

4 шт

998,31

3 993,24

Паста-повязка на основе лецитина с комплексом витаминов для лечения и профилактики гингивита и пародонтита «Витадонт» по ТУ 9391-057-45814830-2001 ВладМиВа

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

221,21

221,21

Паста иодосодержащая для обработки инфицированных каналов зубов и слизистой оболочки полости рта «Белаиод» по ТУ 9391-056-45814830-2002

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

169,02

169,02

Материал стоматологический гемостатический антисептический «Альгистаб» порошок (10г), ОМЕГА

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

8 шт

469,02

3 752,16

Компресс гемостатический и антисептический для альвеол «Альвостаз-жгутики» 1м, ОМЕГА

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

5 шт

782,15

3 910,75

Компресс гемостатический и антисептический для альвеол «Альвостаз — губка» — 30шт

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

22 шт

936,36

20 599,92

Материал стоматологический антисептический гемостатический для зубных лунок «Альванес» по ТУ 9391-048-45814830-2001 паста 20гр\ВладМиВа

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

260,94

260,94

Материал стоматологический антисептический гемостатический для зубных лунок «Альванес» по ТУ 9391-048-45814830-2001 губка 30шт /ВладМиВа

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

782,15

782,15

Материал-жидкость противокариесная профилактическая «Фторлак прозрачный» (13 мл)/Омега

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

2 шт

495,28

990,56

Лак стоматологический фторсодержащий для профилактики кариеса и снижения гиперстезии зубов «Профилак» /Стомадент

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

2 шт

243,10

486,20

Комплект изделий стоматологический для глубокого фторирования эмали и дентина «Глуфторэд» /ВладМива

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

782,15

782,15

Лак стоматологический фторирующий однокомпонентный противокариесный противоболевой «Белак-F» (прозрачный)

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

167,36

167,36

Набор гелей для отбеливания, реминерализации и фторирования эмали «Белагель» Са.Р (шприц 5 мл)/ВладМива

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

1 шт

143,10

143,10

Материал-жидкость стоматологическая для снижения чувствительности и фторирования зубов, серебрения корневых каналов с целью предупреждения начальных и развития вторичных форм кариеса «Аргенат » 1-но комп (5мл)/ВладМиВа

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

3 шт

429,97

1 289,91

Комплект пломбировочного композитного микрогибридного материала светового отверждения «ДентЛайт» (12 шпр*4,5гр) / Владмива

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

7 шт

6 490,89

45 436,23

Материал пломбировочный композитный низкомодульный светового отверждения «Флоурест» (4 шпр*2 гр (цвета А1; А2; А3; А3,5)

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

3 шт

1 533,33

4 599,99

Материал пломбировочный композитный гибридный рентгеноконтрастный светового отверждения набор «УниРест ПЛЮС» в составе: — Шприц с пастой цветов: А2, А3, А3.5, В2, С2, С4, ОА3.5; — Флакон с праймер-адгезивом для эмали и дентина светового отверждения — 1 шт.; — Шприц с гелем для обработки зуба — 1 шт. Принадлежности: — Микроаппликаторы стоматологические — не более 50 шт.; — Игла одноразовая — не более 30 шт.; — Инструкция по применению — 1 шт. — Ложемент «плюс» — 1 шт. — Групповая тара (коробка) — 1 шт.

ОКПД2 20.59.52.110   Пасты для лепки

4 шт

5 032,31

20 129,24

БелАК история успеха производителя для блога ABCP

Сегодня в рубрике “Истории успеха” наш клиент, компания ООО «БелАК-Рус».

«БелАК» основан в 1996 году в Беларуси, а сегодня — это международная группа компаний, представляющая свои интересы в странах таможенного союза и производственные предприятия в Китае. Под контролем ГК полный цикл работы с продуктом — от производства до конечного покупателя. На Платформе можно подключить «БелАК» как поставщика или осуществлять заказы из интернет-магазина БелАК-Рус.

«БелАК» – один из крупнейших производителей профессионального автоинструмента, автоаксессуаров и запасных частей для автомобильного транспорта и спецтехнки как отечественного, так и импортного производства. Сегодня насосы и станции перекачки топлива «БелАК» хорошо известны и востребованы работниками автотранспортных предприятий, владельцами сельско-хозяйственной техники и фермерами, а также частными автолюбителями. В ассортиментном портфеле «БелАК» насосное оборудование занимает значительную долю в обороте наряду с домкратами, смазочным оборудованием, гайковертами и запчастями.

Стремительный вход на рынок: шах и мат

Вхождение «БелАК» на рынок оборудования для перекачки топлива было не только стремительным, но и тактически выверенным. На тот момент «БелАК» уже обладал сильной линейкой традиционных моделей домкратов, смазочного оборудования, гайковертов и готов был к новому захвату рынка. Таким направлением было выбрано оборудование для перекачки топлива. Ситуация на рынке сложилась таким образом, что покупатель мог выбрать, по сути, между двумя вариантами. Первый — это насос, так называемый «ноунэйм», китайского производства без элементарных инструкций и гарантий, но по низкой цене. Покупателю предстояло самостоятельно разобраться с покупкой, докупить недостающие комплектующие, самому настроить соединения, и отдаться на волю случая при запуске этого агрегата. Второй — приобрести насос премиальной марки европейского производства с гарантированным качеством, но по цене в пять-шесть раз выше китайского аналога.  По сути целевых потребителей (владельцев автопарков и сельхоз техники) ни первый, ни второй вариант не устраивал. Первый по качеству, второй по цене.

«БелАК» поставил цель — предложить рынку насосы перекачки топлива, которые соответствовали бы по качеству европейскому уровню, но по гораздо более доступной и привлекательной цене. И эта цель была достигнута! «БелАК» презентовал целую линейку оборудования новых моделей: насосы погружные, насосы не погружные, насосы бочковые, станции перекачки топлива и даже мини ТРК (ссылка на каталог топливного оборудования).

Путь к успеху не был прост. Все дело в мелочах

«БелАК» принял стратегическое решение — все товары компании должны выпускаться только на собственном производстве. Это позволило достичь несколько принципиальных целей:

  • полный контроль качества каждой единицы товара от начала производства до упаковки и отгрузки. Гарантия соблюдения всех стандартов качества конечного продукта и соответствие установленным ГОСТам.
  • предложить покупателям цену на товар от производителя, минуя цепочку перекупщиков, которых обычно до первого покупателя 2-3 звена. Таким образом, цена формировалась на 20-30% ниже, чем на аналоги конкурентов.
  • сформировать при производстве Инженерный центр. Сейчас этот центр имеет многолетний опыт в разработке автоинструментов и запасных частей. В процессе конструирования внедряются современные технологии и собственные разработки. Готовый образец проходит обязательное тестирование. И только после тщательных проверок модель запускается в серию на собственном производстве.
  • создать собственный сервисный центр по постпродажной сервисной поддержке каждого клиента.
  • оснастить каждое изделие полным комплектом документации: инструкция по использованию, сертификаты, подробные рекомендации по использованию. Все документы подготавливаются специалистами «БелАК» и носят точный характер.
  • комплексное маркетинговое сопровождение продукции: от создания индивидуальной упаковки и характеристик товара до прямого продвижения и эффективной системы обратной связи с покупателями.

Получив на склад партии готовой продукции, менеджеры по продажам «БелАК» были настолько уверены в высоком качестве товара, что даже после первого знакомства с потенциальным покупателем отсылали ему образцы моделей для знакомства и проб. Ни одна единица товаров не вернулась обратно. Клиенты, познакомившись с товаром, взяв его в руки и протестировав, приходили к очевидному выводу, что это инструмент профессионального уровня. Предложенная цена не оставляла шансов к отступлению. Следовал заказ. Вслед за первым – второй и третий.

Профессиональное признание и звездное небо над «БелАК»

Профессиональное сообщество сразу очень высоко оценило качество и надежность  товаров «БелАК». Отдельная престижная премия «Автокомпонент года» была присуждена компании в номинации «Насосы для перекачки топлива». На данный момент «БелАК» получил 9 премий «Автокомпонент года» по всем основным направлениям ассортимента: Автомобильные домкраты, Вспомогательные электромоторы, Ручные нагнетатели смазки, Механические гайковерты, Элементы пневматической тормозной системы.

Случилось и неформальное признание рынком

Со временем компания столкнулась с подделками наиболее успешных моделей инструмента «БелАК», которые, конечно, уступали по качеству оригиналам. С одной стороны в этой ситуации есть приятный момент — товар настолько востребован и признан потребителями, что его начали копировать. Но есть и неприятная сторона медали — подрыв репутации компании. Наличие собственного производства помогло исправить ситуацию, были внесены такие инженерные усовершенствования, которые подделать уже невозможно.

Быстрее, выше, сильнее!

Формируя ассортиментный портфель «БелАК» учитывает все потребности как профессионалов, так и автолюбителей в ключевых моделях инструмента и запчастей. Сейчас в ассортименте «БелАК» широчайший выбор домкратов, оборудования для перекачки топлива, смазочного оборудования, гайковертов, электрооборудования, зеркал, тормозной аппаратуры, дисков сцепления, амортизаторов и многого другого.

Приобретая любой товар «БелАК», клиент может сразу им начать пользоваться, не докупая что-то отдельно. «БелАК» гарантирует полную комплектацию товаров всеми крепежами и расходниками, которые могут быть необходимы для эксплуатации сложных инструментов таких как: насосные станции,  тормозная аппаратура, смазочное оборудование.

Возрастающий спрос поставил компанию перед необходимостью развивать логистическую составляющую бизнеса. Сегодня «БелАК» формирует сеть региональных складов. Значимым шагом в развитии логистики «БелАК» стало открытие в августе 2021 года нового склада в Москве. 

Рецепт успеха на поток!

В течение каждого года «БелАК» обязательно пополняет ассортимент новыми моделями. Это необходимая составляющая для роста оборота компании. Обладая собственным инженерным центром и производством «БелАК» гарантирует каждой своей новинке неизбежный успех. Практически все новые модели становятся хитами продаж. На самую свежую новинку «БелАК» “подставки PREMIUM опорные под автомобиль” предзаказы от покупателей пришли еще на стадии производства.

Однажды уже в конце рабочего дня в офис «БелАК» позвонил партнер и, заканчивая разговор об очередном заказе, спросил: как вам удается так крепко влюблять суровых мужиков в ваш товар? Я уже по-настоящему боюсь остаться без вашей продукции. Сотрудник «БелАК» спонтанно ответил: да просто мы не придумываем разные ТУ, мы точно соответствуем ГОСТу. Искренность и точность этого ответа так всем понравилась, что теперь эта фраза написана на стене при входе в  офис «БелАК».

С уважением, директор по маркетингу ООО «БелАК-Рус», Тит Коршиков.

Фторлак для зубов, особенности препарата и его польза

Содержание статьи

Вряд ли найдется человек, которого не пугает встреча с бормашиной. Большинство людей хотели бы попадать в стоматологическое кресло как можно реже. Если вы хотите сохранить зубы здоровыми, защитить их от кариеса и снизить чувствительность, можно использовать Фторлак для зубов. Это вовсе не стоматологическое новшество, средство успешно используется уже очень много лет. Причем проводить обработку зубов препаратом можно и в домашних условиях. Мы расскажем вам, какое положительное действие оказывает Фторлак, как проводить обработку эмали самостоятельно и какие аналоги препарата существуют.

О препарате Фторлак

Стоматологический лак для зубов Фторлак относится к противокариесным препаратам. Он разработан Российской компанией Омега-Дент. Выпускается в небольших флакончиках по 13 мл, имеет вязкую структуру и легкий аромат хвои. Действующее вещество препарата – фторид натрия.

Препарат Фторлак от компании Омега-Дент.

При соблюдении инструкции по использованию средства, Фторлак безопасен для организма. С помощью специального аппликатора составом покрывают зубную эмаль. После нанесения он образует на ней тонкую пленку и восстанавливает минеральный состав и структуру зубной эмали.

Польза Фторлака для полости рта

Пленка из Фторлака сохраняется на поверхности эмали длительное время и насыщает ее фтором. Она является дополнительным защитным барьером для зубов. Польза средства заключается в том, что оно оказывает воздействие на вредоносные бактерии, обитающие в ротовой полости. Эти бактерии скапливаются в зубном налете , и при переваривании глюкозы выделяют кислоты, губительно действующие на эмаль. Фторлак лишает их этой способности.

После нанесения препарата, эмаль становится намного крепче. Если на ней присутствуют небольшие трещинки, они могут сузиться. Фторсодержащие препараты способны «вытаскивать» кальций из слюны. За счет этого происходит насыщение эмали минералами, и она восстанавливает свою структуру. Помимо этого, препарат «работает» в следующих направлениях:

  • уменьшает чувствительность зубов ;
  • повышает срок службы пломб;
  • предотвращает развитие кариеса, пародонтита и других заболеваний полости рта.

Важно: в детском возрасте с помощью препарата можно вылечить кариес.

Осторожность в применении фторсодержащих препаратов

Как и другие медицинские препараты, использовать Фторлак для зубов нужно четко по инструкции. Недопустимо применять средство чаще, чем 1 раз в 6 месяцев. И вот почему: когда узнали об эффективности фтора для укрепления и восстановления эмали, его стали активно использовать в стоматологии. Помимо фторсодержащих паст и процедур с использованием этого микроэлемента, в некоторых странах фтор стали добавлять даже в питьевую воду.

Когда воздействие фтора на зубы изучили более углубленно, специалисты пришли к выводу, что повышенная доза этого микроэлемента может нанести вред здоровью ротовой полости. Из-за большого количества фтора может развиться такое опасное заболевание как флюороз . В легкой форме это заболевание проявляется светлыми полосами на эмали. При тяжелой форме болезни эмаль темнеет и нарушается структура твердых тканей зуба.

При заболевании десен стоматологи рекомендуют использовать специальные пасты. Узнайте, как выбрать зубную пасту при пародонтите .

Все о нейлоновых зубных протезах можно прочесть тут .

Когда применяют Фторлак?

В качестве средства для профилактики кариеса препаратом может пользоваться практически каждый. Исключением являются люди с повышенной чувствительностью к фтору и аллергическими реакциями на компоненты средства, в частности на пихтовый бальзам. Не рекомендовано использовать Фторлак детям  в возрасте до 6 лет. К показаниям для применения средства относится:

  • травмирование эмали;
  • гиперчувствительность зубов;
  • деминерализация эмали;
  • клиновидный дефект в области шейки зуба;
  • профилактика и лечение кариеса.

Кроме того, нанесение стоматологического лака на эмаль рекомендовано после ультразвуковой чистки зубов и перед установкой коронок .

Нанесение Фторлака в стоматологической клинике

Несомненно, в клинике специалист может провести фторирование намного качественнее и быстрее. В среднем, длительность манипуляции не превышает 10 минут. В идеале проводить ее нужно после предварительной профессиональной чистки, например, после AirFlow . На эмали не должно быть зубного налета и камня. Пошагово схема процедуры выглядит так:

При нанесении Фторлака обязательным условием является просушивание эмали от слюны.

  • между десной и щекой специалист разместит ватные тампоны;
  • с помощью специального аппарата поверхность зубов просушивается;
  • используя аппликатор, врач покроет эмаль нижних зубов лаком;
  • после этого лак для зубов наносится на верхнюю челюсть;
  • пациент должен посидеть с открытым ртом около 5 минут, чтобы средство успело просохнуть.

Эффект от процедуры сохраняется на протяжении полугода. Спустя полгода, можно повторно провести фторирование.

Рекомендации после процедуры

В конце процедуры стоматолог даст ряд рекомендаций, соблюдение которых повысит эффективность фторирования:

  • в течение минимум 12 часов нельзя чистить зубы;
  • в этот же период запрещено использовать ополаскиватели для полости рта;
  • в первые сутки стоит ограничить объем потребляемой жидкости;
  • запрещено есть твердые продукты, такие как морковь, яблоки, орехи.

Если пренебречь этими советами, фторсодержащая пленка может разрушиться. Тогда должного терапевтического эффекта наблюдаться не будет.

Использование фторсодержащих средств в домашних условиях

Как видите, особых сложностей в проведении процедуры нет. Купить лак стоматологический можно в аптеке, а работу аппарата для просушки эмали неплохо выполнит обычная салфетка. Так что в целях экономии можно сделать все самостоятельно.

Аналоги Фторлака

Флюокаль является аналогом Фторлака.

Если вы столкнетесь с трудностями покупки Фторлака, не стоит отчаиваться. Хотя этот препарат наиболее популярен, существует целый перечень аналогов, например:

  • Флюокаль;
  • Натриум флуоратум;
  • Натрия фторид;
  • Белак- F.

Совет: покупая фторсодержащее средство для домашнего применения, обратите внимание на то, что многие препараты выпускаются в виде прозрачного или окрашенного раствора. Прозрачный лак для зубов создаст невидимую пленку. Однако окрашенный раствор наносить будет проще, ведь вы сможете видеть, какие участки зубов еще не покрыты средством.

Рекомендации по проведению фторирования дома

Перед проведением процедуры обязательным условием является просушивание эмали от слюны. Придерживайтесь следующих рекомендаций:

  • изолируйте зубы от слюны, используя ватные тампоны;
  • во избежание ожога, не допускайте попадание средства на десну;
  • начинайте нанесение лака с нижней челюсти, тогда вам не придется дважды сушить эмаль.

Рецепты народной медицины нередко справляются с заболеваниями ротовой полости эффективнее лекарственных препаратов. Узнайте эффективные народные средства при пародонтите .

Все о лечении короткой уздечки языка можно узнать тут .

Что делать, если разболелся зуб под коронкой можно прочесть здесь: /zubnaya-bol-pod-koronkoy/ .

Проводя процедуру впервые, вы можете столкнуться с трудностями нанесения лака: избыточным количеством слюны и неудобством нанесения раствора на дальние зубы. В таком случае можно разбить процесс на несколько этапов, например, сначала нанести лак на правую сторону нижней челюсти и дать препарату полностью просохнуть. Затем покрыть вторую часть нижней челюсти и просушить лак. Аналогично, поделив «фронт работ» на 2 части, нанесите средство на верхнюю челюсть. Так времени на фторирование уйдет гораздо больше, но провести его можно качественнее.

Теперь вы знаете, как и зачем используется лак для зубов. Если вы хотите обеспечить своим зубам и деснам защиту от стоматологических заболеваний, стоит взять на вооружение этот метод. Тем более что провести фторирование можно и в домашних условиях, сэкономив при этом бюджет.

ПрофиЛак (10 г) Фторсодержащий лак на основе кедрового бальзама, СтомаДент

ПРОФИЛАК фторсодержащий лак на основе кедрового бальзама, 10 г.

НАЗНАЧЕНИЕ. «ПРОФИЛАК» представляет собой стоматологический фторсодержащий материал. Применяется как профилактическое средство при прогрессивном праксимальном кариесе, при гиперестезии зубов, при некариозных поражениях зубов, при обработке зубов под искусственные коронки, как парадонтальная повязка после проведения профессиональной гигиены полости рта, в детской стоматологии при профилактике кариеса с момента прорезывания зубов.

СВОЙСТВА. «ПРОФИЛАК» — это вязкая жидкость бурого цвета с характерным запахом хвои, сладковатого вкуса, изготовленная на основе природных смол и бальзамов, в своем составе 5% фторида натрия. Механизм противокариозного действия заключается в стимулировании фторидами реминерализующих способностей слюны и в снижении роста микрофлоры зубной бляшки в полости рта. «ПРОФИЛАК» содержит биологически активные компоненты, витамины, микроэлементы, которые благотворно влияют на ткани парадонта, обладают противовоспалительным и антимикробным действием.

«ПРОФИЛАК» наносится тонким слоем на подготовленную поверхность зуба и высушивается за 3 — 5 минут. Пленка материала удерживается на зубах 10-20 часов, обеспечивая насыщение эмали фторидами. Пленка легко удаляется при гигиенической чистке зубов.

КОМПЛЕКТНОСТЬ:
материал «ПРОФИЛАК» во флаконе — 10 г;
инструкция по применению.

ХРАНЕНИЕ. Материал «ПРОФИЛАК» должен храниться при температуре +4 +18°С. Срок годности — 2 года. Перед использованием материал необходимо выдержать при комнатной температуре в течение 1 часа. Не допускается нагрев материала выше +30°С — это приводит к разрушению структуры материала и выпадению осадка.
↓ Показать описание ↓

Свойства
Срок поставки 2-3 дня

Лаборатории, аккредитованные в соответствии со стандартом ISO 15189, выполняют требования Стандарта аккредитации больниц JCI для использования специализированных лабораторий: отчет о консенсусном совещании

Сравнение измеримых элементов Стандарта аккредитации JCI для больниц: 5-е издание (AOP.5.10) и ISO Область применения 15189:2012 подтверждает, что ME JCI для специализированных лабораторий распространяется, если больничная лаборатория аккредитована в соответствии со стандартом ISO 15189. В таблице 1 представлен обзор требований JCI и того, как они гарантируются при аккредитации лаборатории.

Таблица 1 Сравнение элементов JCI и ISO 15189:2012 с объяснением соответствия

ISO 15189 содержит особые требования к использованию специализированных лабораторий. Это означает, что если больничная лаборатория аккредитована, качество специализированных лабораторий тщательно контролируется в соответствии со стандартом ISO. Заведующий лабораторией отвечает за выбор специализированных лабораторий и мониторинг качества их услуг (ISO 15189:2012-4.1.1.4). Должна быть сделана ссылка на любую работу, переданную лабораторией направляющей лаборатории или консультанту (ISO 15189:2012-4.4.1). Кроме того, лаборатория должна иметь задокументированную процедуру выбора и оценки рекомендательных лабораторий (ISO 15189:2012-4.5). Лаборатория несет ответственность за мониторинг качества работы и обеспечение компетентности направляющих лабораторий для проведения требуемых исследований. Договоренности с реферальными лабораториями периодически пересматриваются, и ведется реестр всех реферальных лабораторий.Результаты всех переданных образцов хранятся в течение заранее определенного периода.

JCI требует, чтобы больница имела копию лицензии (JCI — AOP.5.10 M1) и копию аккредитации (JCI — AOP.5.10 M2) для всех специализированных лабораторий. В ходе консенсусного совещания было предложено, чтобы лаборатории в идеале сделали копию лицензии и копию аттестата аккредитации (включая область аккредитации) доступными на своем веб-сайте для пользователей лабораторных услуг или предоставили прямую ссылку на официальные веб-сайты. чтобы гарантировать легкий доступ.

В Бельгии часто обновляемый список лицензированных лабораторий доступен на веб-сайте национальной организации медицинского страхования RIZIV-INAMI [14]. В списке также классифицированы различные типы лабораторий: центры генетики человека (код 996), лаборатории анатомопатологии (код 997) и лаборатории клинической патологии (код 998).

Список всех аккредитованных лабораторий, включая область аккредитации, можно найти на веб-сайте национального органа по аккредитации BELAC [15].С 2006 года BELAC является единственной бельгийской организацией по аккредитации королевским указом [16]. BELAC признан на международном уровне Европейским сотрудничеством по аккредитации (EA), Международным сотрудничеством по аккредитации лабораторий (ILAC) и Международным форумом по аккредитации (IAF). Обзор количества аккредитованных лабораторий в зависимости от типа лаборатории показан на рис. 1. Всего в Бельгии имеется 241 лицензированная медицинская лаборатория. Большая часть лабораторий находится во Фландрии.Большинство медицинских лабораторий в Бельгии являются лабораториями клинической патологии. Есть только восемь центров генетики человека, и все они аккредитованы по стандарту ISO 15189. Аккредитовано около 30 % лабораторий клинической патологии и патологии.

Рис. 1

a Распределение типов медицинских лабораторий в Бельгии ( n  = 241). b Обзор количества аккредитованных лабораторий в Бельгии по типу лаборатории

Zorgnet-Icuro, как зонтичная организация для больниц во Фландрии, собирает данные об аккредитации и публикует на своем веб-сайте список больниц, которые начали процесс аккредитации, включая выбранную программу аккредитации и даты опроса.В таблице 2 представлен обзор статуса аккредитации больниц во Фландрии. Шестьдесят из 65 больниц выбрали для аккредитации. Одна больница неотложной помощи и четыре больницы, прошедшие повторную валидацию, не начнут процесс аккредитации. В декабре 2015 года аккредитацию уже получили семь больниц, из которых пять аккредитованы JCI и две НИАЗ. Еще 53 больницы начали процесс аккредитации.

Таблица 2 Обзор статуса аккредитации больниц во Фландрии

Что касается прозрачности качества лабораторий, образцовой инициативой является база данных Orphanet по редким заболеваниям.Orphanet предлагает всемирную базу данных медицинских лабораторий, которую можно запросить по названию болезни или гена, по стране, городу, лаборатории или специалисту. Интересно, что результаты поиска можно фильтровать по статусу аккредитации и/или участию во внешних схемах обеспечения качества (EQA) [17]. Эта база данных рекомендуется для получения информации об аккредитации и участии в ВОК лабораторий, проводящих исследования в области редких заболеваний.

Согласно JCI, больница должна документально подтвердить, что эта лаборатория участвует в программах проверки квалификации (JCI — AOP.5.10 М3). Однако это требование выполняется автоматически, если реферальная лаборатория аккредитована по ISO 15189 для проведения этих исследований. Действительно, аккредитация подразумевает, что лаборатория участвует во внешних программах оценки качества (5.6.3). Более того, в Бельгии участие в программах ВОК является обязательным для лицензирования королевским указом, помимо аккредитации [2–4, 18]. Это означает, что даже неаккредитованные лаборатории должны участвовать в программах ВОК, предлагаемых Научным институтом общественного здравоохранения (WIV-ISP), чтобы сохранить свою лицензию и получить компенсацию за медицинские анализы.

В связи с требованиями ISO 15189 к Руководству по качеству, доступности информации для пользователей лабораторных услуг и установлению показателей качества (ISO 15189:2012—4.2.2.2 и 5.4.2.d, 5.4.2 .h, 5.4.2.j и 4.14.7), можно контролировать частоту и тип данных об ожидаемых результатах работы реферальной лаборатории (JCI — AOP.5.10.1 M1).

Как указано в стандарте ISO, информация, доступная для пользователей лабораторных услуг, включает типы предлагаемых клинических услуг (включая исследования, направленные в другие лаборатории), информацию о предлагаемых исследованиях (требуемые образцы, объемы образцов, меры предосторожности, время выполнения, и т. д.), инструкции по заполнению формы запроса, инструкции по подготовке пациента, инструкции по транспортировке образцов, требования о согласии пациента, критерии принятия и отказа от образцов, список известных факторов, влияющих на исследование или интерпретацию результатов и т. д. , Лаборатория устанавливает показатели качества для мониторинга и оценки производительности в критических аспектах процессов до исследования, исследования и после исследования (например, количество неприемлемых образцов, количество ошибок регистрации и т. д.).).

Показатели качества оцениваются в рамках запланированного процесса (установление целей, методологии, интерпретации, пределов, плана действий и продолжительности измерения) и периодически пересматриваются для обеспечения соответствия. Время оборота, отражающее клинические потребности, устанавливается и подлежит периодической оценке.

Политика контроля качества, объем системы управления качеством, структура управления, роли и обязанности руководства лаборатории, а также структура документации подробно описаны в Руководстве по качеству.

Кроме того, Международные цели безопасности пациентов JCI требуют определения критических значений для каждого типа диагностического теста и процесса отчетности о критических результатах (IPSG.2.1).

ISO 15189 требует пересмотра системы менеджмента качества (ISO 15189:2012—4.15) через запланированные промежутки времени (не более 12 месяцев) для обеспечения ее пригодности, адекватности и эффективности, а также поддержки ухода за пациентами. В этот управленческий обзор включен большой объем результатов оценки (отзывы пользователей, внутренние аудиты, показатели качества, эффективность поставщиков, результаты участия во внешней оценке качества, управление рисками и т. д.).). Эта информация анализируется на предмет причин несоответствий и закономерностей, указывающих на проблемы процесса. Оцениваются возможности для улучшения и необходимость изменений в системе менеджмента качества, и действия, вытекающие из анализа со стороны руководства, выполняются в течение определенного периода времени. Эти действия охватывают требования JCI, указанные в AOP.5.10.1 M2, M3 и M4.

Кроме того, компетенция и качество выбранных справочных лабораторий и консультантов контролируются, периодически оцениваются и ведется реестр всех справочных служб (ISO 15189:2012-4.с 5.1а по 4.5.1.г). Директор лаборатории является лицом, обладающим необходимой компетенцией, и несет ответственность за выбор специализированных лабораторий и мониторинг качества их услуг (ISO 15189:2012-4.1.1.4.i). Эти требования ISO 15189 обеспечивают периодическую проверку данных об ожидаемых характеристиках квалифицированным назначенным лицом (AOP.5.10.1 M2, M3 и M4).

Разработка автоматизированных высокопроизводительных экспериментов по непрерывному выращиванию клеток с использованием eVOLVER

J Vis Exp. Авторская рукопись; доступно в PMC 2019 11 сентября.

Опубликовано в окончательной редактированной форме AS:

PMCID: PMC6738936

NIHMSID: NIHMS1048962

, 1, 2 , 1, 2 , 1, 3 , 1, 2 , 4 , 4 и 1, 2, 5 5

Zachary J. Heins

1 Центр биологической конструкции, Бостонский университет, Бостон, MA 02215, США

2 Биомедицинская инженерия, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

Кристофер П.Mancuso

1 Центр биологического дизайна, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

2 Факультет биомедицинской инженерии, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

Центр биологического дизайна Szilvia Kiriakov

5

, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

3 Программа молекулярной биологии, клеточной биологии и биохимии, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

Брэндон Г. Вонг

1 Центр биологического дизайна, Бостон Университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

2 Кафедра биомедицинской инженерии, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

Калеб Дж.Bashor

4 Факультет биоинженерии, Университет Райса, Хьюстон, Техас 77005, США

Ахмад С. Халил

1 Центр биологического дизайна, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215 5 02215

2 90 Департамента США

90 Биомедицинская инженерия, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

5 Институт биологической инженерии Висса, Гарвардский университет, Бостон, Массачусетс 02115, США

1 Центр биологического дизайна, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

2 Факультет биомедицинской инженерии, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

3 Программа молекулярной биологии, клеточной биологии и биохимии, Бостонский университет, Бостон, Массачусетс 02215, США

9 Департамент биоинженерии, Университет Райса, Хьюстон, Техас 77005, США

5 Институт биологической инженерии Висса, Гарвардский университет, Бостон, MA 02115, USA

Окончательная отредактированная версия этой статьи доступна по адресу J Vis Exp См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Методы непрерывного культивирования позволяют выращивать клетки в количественно контролируемых условиях окружающей среды и, таким образом, широко используются для измерения фенотипов приспособленности и улучшения нашего понимания того, как генотипы формируются путем отбора. Обширные недавние усилия по разработке и применению нишевых устройств непрерывного культивирования выявили преимущества проведения новых форм контроля клеточных культур. Это включает в себя определение давления индивидуального отбора и увеличение пропускной способности для исследований, начиная от долгосрочной экспериментальной эволюции и заканчивая отбором библиотек по всему геному и характеристикой синтетических генных цепей.Для удовлетворения этого растущего спроса недавно была разработана платформа eVOLVER: платформа непрерывного культивирования с высокой степенью масштабируемости, гибкости и автоматизации. eVOLVER предоставляет единую платформу стандартизации, которую можно (пере)конфигурировать и масштабировать с минимальными усилиями для выполнения множества различных типов высокопроизводительных или многомерных экспериментов по отбору роста. Здесь представлен протокол, предоставляющий пользователям платформы eVOLVER описание настройки системы для проведения пользовательского крупномасштабного эксперимента с непрерывным ростом.В частности, протокол помогает пользователям запрограммировать систему для мультиплексирования двух давлений отбора — температуры и осмолярности — во многих флаконах eVOLVER для количественной оценки ландшафтов пригодности мутантов Saccharomyces cerevisiae с высоким разрешением. Мы показываем, как устройство может быть сконфигурировано как программно, с помощью его программного обеспечения с открытым исходным кодом, так и физически, путем организации жидкостной и аппаратной компоновки. Подробно описан процесс физической настройки устройства, программирования процедуры культивирования, мониторинга и взаимодействия с экспериментом в режиме реального времени через Интернет, отбора проб флаконов для последующего автономного анализа и анализа данных после эксперимента.Это должно послужить отправной точкой для исследователей из различных дисциплин, чтобы применить eVOLVER при разработке своих собственных сложных и высокопроизводительных экспериментов по выращиванию клеток для изучения биологических систем и управления ими.

Ключевые слова: eVOLVER, непрерывное культивирование, микробные популяции, автоматизация лаборатории, селекция роста, экспериментальная эволюция, фитнес-ландшафт, системная биология над экспериментальными параметрами.Этот протокол демонстрирует, как применять систему для проведения сложного эксперимента по фитнесу, помогая пользователям программировать автоматизированный контроль над многими отдельными культурами, измеряя, собирая и взаимодействуя с экспериментальными данными в режиме реального времени.

ВВЕДЕНИЕ:

Методы непрерывного культивирования клеток, впервые разработанные почти 70 лет назад 1, 2 , переживают недавнее возрождение 3, 4 . Это связано с стечением факторов. Во-первых, развитие высокопроизводительных методов omics, которые позволили считывать и генерировать большое количество генотипов 5, 6 , создало сопутствующую потребность в экспериментальных методах, которые облегчают хорошо контролируемый рост клеток и фенотипирование.С этой целью непрерывное культивирование представляет собой мощный экспериментальный подход к извлечению выгоды из новых достижений в области геномики. Облегчая отбор/эксперименты по росту клеточных популяций в точно контролируемых (и динамических) условиях окружающей среды, непрерывное культивирование предоставляет средства для строгого сопоставления генотипов с фенотипами 7, 8 , количественной характеристики сконструированных штаммов и организмов 9 и отслеживания адаптивных генетических изменения в лабораторных исследованиях эволюции 10–12 .

Во-вторых, недавнее появление доступных методов прототипирования, таких как аддитивное производство и аппаратные и программные элементы с открытым исходным кодом, позволило более широкому кругу пользователей проектировать и создавать собственные экономичные формы систем непрерывного культивирования непосредственно в лаборатории. . Все это привело к захватывающему набору самодельных (DIY) устройств, которые выполняют функции непрерывного культивирования, таких как хемостат 13 , турбидостат 14 или морбидостат 15 .К сожалению, несмотря на успешное решение конкретных (нишевых) проблем, для которых они были разработаны, эти специальные решения, как правило, не имеют возможности масштабирования по производительности и/или сложности экспериментального дизайна.

Система eVOLVER была разработана с целью создания единой платформы, которая может удовлетворить растущие экспериментальные потребности непрерывного культивирования и соответствовать скорости и масштабу новых геномных методов 16 (). В конструкции eVOLVER реализованы общие принципы, лежащие в основе технологий с высокой степенью масштабируемости из других дисциплин 17 , включая стандартизированные размеры, модульные компоненты и принципы проектирования с открытым исходным кодом.Таким образом, решения для новых нишевых приложений могут быть разработаны без значительных изменений системы. eVOLVER, состоящий из модульного ПО с открытым исходным кодом, аппаратного обеспечения, электроники и веб-программного обеспечения, является первой автоматизированной системой непрерывного культивирования, которую можно экономично и легко перенастроить для выполнения практически любого типа высокопроизводительного выращивания. эксперимент. Благодаря модульным и программируемым интеллектуальным рукавам, в которых размещены все датчики и приводы, необходимые для управления отдельными культурами, eVOLVER уникальным образом обеспечивает масштабирование как производительности, так и индивидуального контроля условий культивирования.Кроме того, как веб-платформа, eVOLVER обменивается данными и информацией с удаленными компьютерами в режиме реального времени, обеспечивая одновременный мониторинг сотен отдельных культур и автоматические возмущения культур с помощью произвольно определенных алгоритмов управления.

Обзор платформы eVOLVER и экспериментального плана.

( A ) eVOLVER — это автоматизированная платформа непрерывного культивирования, обеспечивающая многопараметрический контроль условий культивирования. Платформа состоит из смарт-рукавов, в которых размещены датчики и приводы для контроля условий культивирования, массива перистальтических насосов для протекания сред и отходов в культурах и из них, сенсорного экрана для ручного взаимодействия с устройством и компьютера, используемого для взаимодействия с облачная инфраструктура, куда передаются данные с платформы.( B ) eVOLVER может быть сконфигурирован несколькими способами: физически, посредством ввода клеток и сред, а также программно путем настройки алгоритмов, управляющих модулями культуральных флаконов Smart Sleeve. Это можно использовать для программирования многомерной селекции/градиентов окружающей среды с высоким разрешением, с выходными данными, состоящими из физически собранных клеток в определенные моменты времени и потоковой передачей данных культуры в реальном времени. ( C ) Настройка eVOLVER для проведения эксперимента по приспособленности роста в двухмерном градиенте отбора, состоящем из температуры и осмотического стресса.Флаконы с культурой eVOLVER засевали референтным и вариантным штаммами дрожжей в равных пропорциях. Процедура турбидостата была запрограммирована для поддержания всех культур в экспоненциальной фазе в определенном окне ОП (ОП 0,2–0,3). Условия температуры и среды варьировались в массиве Smart Sleeve для формирования двух независимых градиентов напряжения. Базовая среда состояла из YPD (2% глюкозы) + 100 мкг/мл карбенициллина + 25 мкг/мл хлорамфеникола в качестве меры предосторожности против бактериального заражения. Составы сред варьировали путем добавления дополнительного NaCl до 0 М, 0.6 М, 0,8 М или 1,0 М. Температуру флакона программировали на одно из четырех значений: 30 °С, 35 °С, 37 °С или 39 °С. ( D ) Примеры необработанных выходных данных для культуры OD и популяционных фракций из трех испытанных условий. Конкурентный эксперимент продолжался в течение 72 часов, отбор проб осуществлялся через 24 часа, а затем каждые 12 часов до завершения эксперимента.

В предыдущей работе 16 высокая производительность eVOLVER была продемонстрирована в долгосрочных экспериментах в течение сотен часов работы, а также его способность культивировать различные организмы, начиная с E.coli и S. cerevisiae к неодомашненным микробам. Была проведена серия различных экспериментов по отбору роста, в которых программно определяемые многомерные градиенты отбора применялись к множеству индивидуальных условий культивирования, а результирующие ландшафты клеточной пригодности были количественно оценены. Здесь цель состоит в том, чтобы предоставить пользователям eVOLVER описание того, как использовать систему для проектирования и экспериментов такого типа. В качестве наглядного примера можно привести методы количественной оценки фитнес-ландшафта S.cerevisiae представлены мутанты в двухмерном градиенте окружающей среды, состоящем из температуры и осмотического стресса. Протокол помогает пользователям настроить структуру eVOLVER для этого эксперимента как программно, используя программное обеспечение для настройки настраиваемых процедур контроля мутности и температуры для каждой из 16 параллельных непрерывных культур, так и физически, с помощью компоновки жидкости для надлежащего направления сред с различной концентрацией соли. . Этот протокол должен служить общей рубрикой для настройки eVOLVER для выполнения широкого спектра автоматизированных экспериментов с непрерывным культивированием для различных исследований и дисциплин.

ПРОТОКОЛ:

1. Подготовка среды, флаконов и инокулята

ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол предполагает, что пользователи уже откалибровали систему eVOLVER и используют конфигурацию Smart Sleeve, описанную в предыдущей работе 16 . Умные рукава легко переделываются или модифицируются, но детали настройки громкости и параметров управления могут отличаться для альтернативных конфигураций.

  • 1.1.

    За день до эксперимента приготовьте 2 мл ночных жидких культур S.cerevisiae BY4741 эталонный штамм и вариантные штаммы в среде YPD (дрожжевой пептон-декстроза) при 30 °C в инкубаторе-качалке со скоростью не менее 300 об/мин.

  • 1.2.

    Перенесите стерильную среду YPD в чистые автоклавированные флаконы с трубками. В качестве альтернативы среды можно автоклавировать непосредственно в бутылях, предварительно снабженных трубками.

    ПРИМЕЧАНИЕ. Для крепления трубок к бутылям необходимо просверлить отверстие в крышке и пропустить через нее трубку с соединителями, чтобы зафиксировать ее на месте.См. Таблица материалов .

  • 1.3.

    Добавьте мешалку в каждую пробирку и завинтите крышку пробирки, снабженную соломинками для притока и оттока. Визуальным осмотром убедитесь, что все компоненты чистые.

  • 1.4.

    Поместите флаконы в автоклавируемый штатив, накройте фольгой и автоклавируйте в гравитационном или вакуумном цикле с 20-минутной стерилизацией.

2. Постановка эксперимента

  • 2.1. В трех больших стаканах приготовьте 500 мл 10% отбеливателя, 200 мл 10% отбеливателя и 300 мл 70% этанола.
  • 2.2. Используя переключатели на устройстве eVOLVER, включите источник питания 5 В на устройстве eVOLVER, подождите 5 с, затем включите источник питания 12 В.
  • 2.3. При использовании нескольких флаконов из одной и той же бутыли со средой соедините несколько линий подачи среды с помощью разветвителей трубок. Индивидуальные разветвители трубок могут быть изготовлены из компонентов Luer.
  • 2.4. Погрузите линии ввода средств массовой информации в первый стакан для отбеливания и линии оттока средств массовой информации во втором стакане для отбеливания. Поместите нижний конец линий ввода носителя во второй стакан с линиями оттока.Поместите линии отходов в бутыль для отходов.
  • 2.5. Добавьте 1–2 л отбеливателя в большую пустую бутыль для отходов, которая стерилизует отходы, образовавшиеся во время эксперимента. Проконсультируйтесь с координатором по технике безопасности, чтобы обеспечить надлежащую утилизацию отходов.
  • 2.6. Используя сенсорный экран на eVOLVER, перейдите в раздел настройки и запустите все насосы на 20 с, чтобы заполнить линии жидкости 10% отбеливателем. Во время работы убедитесь путем визуального осмотра, что все линии заполнены и что насосы работают нормально. Оставьте отбеливатель в линиях не менее чем на 30 минут для стерилизации.
  • 2.7. Снова запустите насосы с помощью приложения на сенсорном экране, пока линии не перестанут находиться под водой, проталкивая воздух через линии, чтобы удалить как можно больше отбеливателя.
  • 2.8. Поместите линии ввода носителя в стакан с этанолом и повторите, как указано выше, заполняя линии этанолом и промывая воздухом.

    ПРИМЕЧАНИЕ. Так как этанол быстро убивает, нет необходимости ждать 30 минут для стерилизации.

  • 2.9. Присоедините линии ввода медиа к бутылкам с люэровскими разъемами и запустите насосы, пока носитель полностью не пройдет через линии, смывая остаточный этанол.
  • 2.10. Частично вставьте стерилизованные флаконы в смарт-рукава eVOLVER и закрепите линии в соответствующих местах в соответствии с цветовой маркировкой на линиях. Начните с присоединения входных линий к короткой соломинке для притока, а затем линий отходов к длинной соломинке для оттока.

    ОСТОРОЖНО: Крайне важно проверить наличие ослабленных соединений или неправильно проложенных линий. Несоблюдение этого требования может привести к переполнению и потенциальному повреждению смарт-рукава.

  • 2.11. Запустите все насосы с шагом 10 с, чтобы заполнить флаконы средствами массовой информации.С помощью визуального осмотра убедитесь, что отводящие насосы эффективно удаляют среду через отводящие соломинки, чтобы предотвратить переполнение. Если соломинки для оттока не работают эффективно, проверьте соединения жидкостной линии и перистальтический насос. При необходимости откорректируйте или замените детали.
  • 2.12. Проталкивайте флаконы вниз до тех пор, пока они полностью не будут заключены в смарт-рукав.
  • 2.13. Установите начальные условия для экспериментальных параметров с помощью сенсорного экрана eVOLVER на интерактивной странице настройки. Для всех флаконов установите температуру на 30 °C и скорость перемешивания на 10.Это можно сделать для всех флаконов одновременно, проведя пальцем по сенсорному экрану, чтобы выбрать все флаконы.

3. Настройка программного обеспечения eVOLVER и программирование процедур алгоритмической культуры

  • 3.1.

    В приборной панели eVOLVER на компьютере перейдите на страницу диспетчера экспериментов. Выберите базовый эксперимент на панели навигатора экспериментов или существующий эксперимент в качестве отправной точки и нажмите «Клонировать новый».

    ПРИМЕЧАНИЕ. Можно использовать эксперименты из других групп, вставив ссылку GitHub на репозиторий, где экспериментальное определение сохранено, в диспетчере экспериментов.

  • 3.2.

    Укажите название эксперимента и устройство eVOLVER, на котором будет проводиться эксперимент. Убедитесь, что выбраны нужные параметры калибровки, изменив эти поля на странице.

  • 3.3.

    Используйте селектор виал и панели определения параметров, чтобы установить экспериментальные условия. Например, чтобы установить температуру для виал от 0–4 до 30 °C, выберите виалы в селекторе виал, установите определение параметра на 30 и нажмите Set .Повторите это для ОП, чтобы установить верхний и нижний порог для каждого флакона.

  • 3.4.

    После завершения определения экспериментальных параметров сохраните эксперимент, нажав Сохранить , и щелкните Запустить , чтобы запустить его.

4. Инициирование эксперимента и мониторинг в режиме реального времени

  • 4.1.

    После начала эксперимента перейдите к панели данных в реальном времени на интерактивной панели. Для каждого флакона проверьте, чтобы значения OD оставались равными нулю, а температура соответствовала или приближалась к запрограммированному уровню, просматривая графики.

  • 4.2.

    Для приготовления инокулята измерьте оптическую плотность ночных культур, рассчитайте желаемую кратность разведения, исходя из объема флакона 25 мл, и пипеткой перенесите рассчитанный объем инокулята во флаконы через отверстие для отбора проб. Например, для достижения желаемой исходной оптической плотности около 0,05 в культуральном флаконе из ночных культур с оптической плотностью 2,0 в каждый флакон следует добавить 625 мкл клеток.

  • 4.3.

    Проверьте графики на приборной панели, чтобы убедиться, что графики OD были соответствующим образом обновлены.На графиках должно быть видно увеличение почти до желаемой начальной ОП.

  • 4.4.

    Отслеживайте различные типы данных (такие как OD, температура, скорость роста, поколения и потребление среды) на протяжении всего эксперимента, просматривая соответствующие графики на панели управления. Эти значения могут информировать пользователя об экспериментальных решениях (например, планировать временные точки) или даже использоваться в функциях для выполнения автоматизированной обратной связи.

  • 4.5.

    Чтобы заменить бутылки с средами во время эксперимента, приостановите эксперимент на панели диспетчера экспериментов, чтобы предотвратить возникновение событий насоса.Быстро отвинтите линию среды от пустой бутылки и подключите ее к новой бутылке. Не прикасайтесь к концам трубки, чтобы предотвратить загрязнение. Возобновите эксперимент в диспетчере экспериментов.

5. Отбор проб дрожжевых клеток из флаконов eVOLVER

  • 5.1.

    Приготовьте раствор циклогексимида для ингибирования синтеза белка и фиксации дрожжевых клеток для анализа методом проточной цитометрии. В коническую трубку объемом 15 мл добавьте 12 мл PBS и 12 мкл циклогексимида 20 мг/мл и вортексе в течение 5 с.

  • 5.2.

    С помощью многоканальной пипетки внесите аликвоту по 100 мкл в каждую лунку 96-луночного круглодонного планшета.

  • 5.3.

    Оберните планшет алюминиевой фольгой для защиты от света и храните при температуре 4 °C до тех пор, пока он не понадобится.

  • 5.4.

    Для отбора проб введите пипетку через отверстие для отбора проб на крышке флакона, используя удлиненные наконечники на 200 мкл.

  • 5.5.

    Пипеткой внесите 100 мкл из флакона в лунку фиксирующего планшета, перемешав 2–3 раза путем пипетирования вверх и вниз, затем соберите в фольгу и доведите температуру планшета до 4 °C.

6. Разбор эксперимента и очистка

  • 6.1.

    Приготовьте 1 л 10% отбеливателя и два 500 мл раствора деионизированной воды в больших стаканах.

  • 6.2.

    Остановите эксперимент, отправив команду остановки в панели менеджера экспериментов. Данные по-прежнему хранятся в облачной базе данных, и их можно просмотреть позже на панели данных в режиме реального времени или загрузить для анализа в автономном режиме.

  • 6.3.

    Извлеките флаконы из Smart Sleeves и поместите их в автоклавную стойку, чтобы избежать переполнения на последующих этапах.

  • 6.4.

    Отвинтите линии подачи среды от бутылок со средой и поместите их в химический стакан с 10% отбеливателем. Запускайте помпы из пользовательского интерфейса eVOLVER, как при настройке, для стерилизации линий и флаконов.

  • 6.5.

    Отсоедините линии от флаконов и погрузите линии в деионизированную воду. Запустите насосы, чтобы вымыть весь отбеливатель из системы сначала деионизированной водой, а затем воздухом.

  • 6.6.

    Выключите eVOLVER, сначала отключив питание 12 В, подождав 5 с, а затем отключив питание 5 В.

  • 6.7.

    Замочите мешалки и колпачки в 10% отбеливателе, затем промойте деионизированной водой. Обязательно промойте соломинки для притока и оттока каждого колпачка, пропустив через них деионизированную воду. Почистите флаконы щеткой для пробирок, если на стенках образовалась пленка.

  • 6.8.

    Надлежащим образом утилизируйте отходы и тщательно промойте контейнеры для отходов.

    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. Контейнеры для отходов будут содержать смесь 10% отбеливателя, стерилизованных отходов клеточной культуры и следовых количеств этанола. Проконсультируйтесь с координатором по технике безопасности для правильного обращения и утилизации.

7. Количественная оценка пригодности с использованием анализа проточной цитометрии фракционных популяций

  • 7.1.

    Проанализируйте собранные образцы из секции 5 с помощью проточного цитометра, оснащенного соответствующим флуоресцентным каналом и детекторами 16 .

  • 7.2.

    Соберите не менее 10 000 событий на образец и выполните гейтирование интактных клеток, используя данные прямого и бокового рассеяния.

  • 7.3.

    Гейт на основе соответствующего канала флуоресценции (например, GFP) для определения фракционного распределения каждой популяции.

  • 7.4.

    На компьютере сохраните данные в нужном месте со страницы диспетчера экспериментов, нажав кнопку «Экспорт».

  • 7.5.

    Из файлов данных eVOLVER определите количество поколений, завершенных к каждому моменту времени для каждого флакона.( rt ) на каждый сегмент, что дает r, скорость роста 16 . Затем количество поколений за период времени рассчитывается по следующей формуле:

    поколения=промежуток времени×рост(2)

  • 7.6.

    Постройте логарифмическое соотношение меченых и немеченых популяций по данным проточной цитометрии в зависимости от числа поколений из приведенных выше расчетов на момент взятия проб. Определите линейную область и подгоните наклон согласно следующему уравнению.Этот наклон обычно определяется как соревновательная пригодность 18, 19 .

ln(variantstrain%referencestrain%)=наклон*поколения+отрезок

ПРЕДСТАВИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ:

Описанный здесь протокол был использован для построения карт пригодности для генетических вариантов S. cerevisiae в двухмерном градиенте стресса температуры и солености. В частности, для каждого вариантного штамма мы использовали eVOLVER для проведения парных экспериментов по конкуренции с флуоресцентно меченым эталонным штаммом ( S.cerevisiae штамм BY4741 с интегрированным конститутивным репортером mNeonGreen) в 16 различных комбинациях этих стрессов (). Для вариантов были выбраны два нокаутных штамма, каждый из которых, по прогнозам, будет чувствителен к одной из осей стрессовых условий: ΔPRX1 , который, как сообщается, имеет дефекты приспособленности при высоких температурах 20 и ΔPBS2 с дефектами приспособленности при высоких концентрациях соли 21 . В качестве контрольного варианта использовали немеченый штамм BY4741 дикого типа, который, как ожидается, будет действовать аналогично эталонному штамму.В общей сложности эти три 72-часовых эксперимента были проведены одновременно с 48 флаконами на трех устройствах eVOLVER (16 флаконов), и все они запускались с одного компьютера.

Интерактивная информационная панель eVOLVER используется для навигации по большому количеству данных, которые генерируются во время каждого эксперимента (). Репрезентативные следы ОП для всех 16 флаконов одного устройства eVOLVER показаны на рис. Каждая кривая отображает характерный пилообразный рисунок из алгоритма управления турбидостатом, который использует обратную связь по OD для запуска разведений и поддержания культур в узком диапазоне плотностей (0.2–0,3 в данном случае). Данные о наружном диаметре и температуре постоянно измеряются, передаются в облачную базу данных и обновляются в режиме реального времени на интерактивной панели управления eVOLVER. На основе непрерывно поступающих данных можно рассчитать показатели более высокого порядка (например, скорость роста, общее количество поколений) и нанести их на панель управления () и даже использовать в качестве параметров обратной связи в различных схемах отбора (например, морбидостат).

Панель мониторинга данных eVOLVER для анализа данных в реальном времени.

( A ) Данные eVOLVER обрабатываются и передаются в режиме реального времени через облачное программное обеспечение на интерактивную панель управления.С помощью панели управления пользователи могут определять и инициировать свои собственные процедуры культивирования на подключенном eVOLVER, отслеживать текущие эксперименты на всех устройствах eVOLVER и при необходимости изменять экспериментальные условия вручную на отдельном флаконе или наборе флаконов. ( B ) Кривые ОП для каждого флакона в матрице условий, проверенных на протяжении всего эксперимента. Трассировки можно просматривать в режиме реального времени, чтобы убедиться, что эксперимент проходит так, как нужно, и использовать после эксперимента для дальнейшего анализа. ( C ) Темпы роста и поколения клеток могут быть рассчитаны на основе следов OD на лету, чтобы отслеживать ход эксперимента.

Для создания карт пригодности мы измеряем скорость, с которой эталонный штамм превосходит вариантный штамм, путем включения измерений проточной цитометрии и данных о росте eVOLVER. В частности, фракции популяции рассчитывают как логарифмическое отношение вариантного штамма к эталонному штамму с использованием данных проточной цитометрии для каждого образца в момент времени. Для каждой культуры и момента времени прошедшее количество поколений интерполируется из данных скорости роста eVOLVER в каждом периоде разбавления. При построении логарифмических соотношений в зависимости от поколений начинают проявляться качественные различия между условиями ().Чтобы рассчитать приспособленность, наклон проходит через линейную часть каждого графика 18, 19 , что дает количественное значение приспособленности (со знаком и скоростью), которое описывает, как вариантный штамм конкурирует с эталонным штаммом (). В этом эксперименте отрицательные значения пригодности указывают на то, что вариантный штамм проигрывает эталонному штамму. Построение тепловых карт на основе всех расчетов фитнеса позволяет визуализировать двухмерный ландшафт фитнеса, выявляя тонкие количественные различия в производительности между штаммами и условиями ().

Строительство поверхностей для фитнеса.

( A ) Естественный логарифм доли клеточной популяции (вариантный штамм/эталонный штамм) в зависимости от поколения клеток. Цвет указывает на температуру выделения, а черточки обозначают концентрацию соли. ( B ) Для количественной оценки относительной пригодности варианта к эталонному штамму показатель пригодности выводится из скорости, с которой доля клеточной популяции изменяется в течение поколений. Этот показатель рассчитывается из линейной области графиков клеточной доли с использованием минимум трех точек.( C ) Показатели относительной пригодности отображаются на тепловой карте для построения поверхности пригодности по градиентам стресса окружающей среды. Условия в верхнем правом углу (39 ° C / 1,0 М NaCl) для дикого типа и ΔPBS2 не включены в этот анализ, поскольку культуры прошли недостаточное количество поколений (см. Репрезентативные результаты).

На тепловых картах пригодности мы видим, что каждый вариант штамма демонстрирует дефекты приспособленности, которые проявляются по-разному. ΔPRX1 в первую очередь чувствителен к высоким температурам, но солевой стресс, по-видимому, имеет аддитивный эффект, увеличивая дефект пригодности.Наоборот, ΔPBS2 демонстрирует дефекты пригодности, главным образом, в ответ на высокие концентрации соли с минимальными различиями по оси температуры. Эти результаты подчеркивают полезность экспериментов по отбору с высоким разрешением, особенно для расшифровки взаимодействий множества стрессоров окружающей среды, которые могут иметь аддитивные, синергетические или эпистатические эффекты.

Наконец, важно отметить, что в некоторых случаях, особенно в тяжелых стрессовых условиях, расчеты приспособленности могут привести к преувеличенным или искаженным результатам.Например, ΔPBS2 демонстрирует крутой положительный наклон в условиях 39 °C/1 М NaCl по сравнению с эталонным штаммом (). Это связано с плохим ростом обоих штаммов, что отражено в данных дикого типа и ограничивает полезность этой конкретной метрики в этих условиях. Недостаточное количество поколений приводит к 1) плохому разделению временных точек, что мешает подбору наклона, и 2) чувствительности к стохастическим эффектам, возникающим из-за запаздывания фазы. Хотя мы не решили делать это в этом исследовании, данные о росте в реальном времени, собранные eVOLVER во время эксперимента, можно было использовать для принятия решения о продлении эксперимента и сборе дополнительных временных точек для этого состояния без особых усилий.В последующих экспериментах начальные отношения также можно было бы модулировать, чтобы увеличить длину линейной области до того, как произойдет насыщение.

ОБСУЖДЕНИЕ:

Отбор роста является незаменимым инструментом в биологии, широко используемым для создания и характеристики фенотипических различий между клеточными популяциями. В то время как периодическое культивирование допускает ограниченный отбор по росту, методы непрерывного культивирования значительно расширяют степень контроля и предсказуемости этих экспериментов за счет точного регулирования формы и динамики отбора для получения воспроизводимых количественных результатов 22 .Непрерывное культивирование использовалось для строгого контроля отбора для библиотек с высоким разнообразием 20, 23–25 и для реализации сложных адаптивных режимов в экспериментальной и направленной эволюции 11, 12, 26, 27 . Непрерывное культивирование также позволяет точно характеризовать клетки в целом ряде количественно контролируемых условий, чтобы лучше понять сложные генетические системы и оптимизировать сконструированные биопродукционные штаммы 9, 14, 28 .

Однако универсального протокола для непрерывного культивирования не существует, так как незначительные изменения условий отбора могут привести к резким изменениям биологических результатов 4, 29, 30 .Экспериментаторы должны иметь возможность выбирать между режимами отбора и соответствующим образом адаптировать экспериментальные протоколы и оборудование. Помимо возможности выбора между контрольными параметрами, такие системы в идеале должны быть достаточно сложными, чтобы независимо управлять несколькими параметрами одновременно в высокопараллельных экспериментах, которые необходимы для расшифровки взаимодействующих входных данных в сложных биологических системах (например, эпистаза). eVOLVER решает эту проблему, позволяя пользователям произвольно программировать контроль обратной связи между условиями культивирования и жидкостными функциями, чтобы определить узкоспециализированные экологические ниши.

Чтобы преодолеть ограничения в текущей настройке и расширить или изменить параметры управления, смарт-рукав можно легко переработать, добавив новые датчики или исполнительные механизмы. Кроме того, уменьшение объема флакона уменьшит расходы на среду, которые могут быть значительными при непрерывном культивировании. В то время как текущая конструкция позволяет измерять и контролировать температуру, перемешивание культур, световую индукцию, мутность и жидкости, другие параметры должны измеряться снаружи путем отбора проб из флаконов.Текущая работа включает в себя включение возможности контролировать ферментативную активность с помощью люциферазы и регулировать растворенный кислород и рН непосредственно в культурах eVOLVER. Кроме того, хотя это и не продемонстрировано в этой работе, eVOLVER может взаимодействовать с новыми миллифлюидными мультиплексирующими устройствами 16 , которые основаны на принципах крупномасштабной интеграции (исходя из электроники и принятых в микрофлюидике), чтобы недорого обеспечить более сложную работу с жидкостями (например, мультиплексирование). жидкостные входы, переносы из флакона во флакон).Эти модули мокрого оборудования могут быть полностью спроектированы и изготовлены в лаборатории, что позволяет пользователям направлять жидкости путем программного запуска различных комбинаций клапанов в автоматизированных жидкостных процедурах. Это позволяет пользователям отказаться от жестких жидкостных конструкций, традиционно используемых в непрерывном культивировании, а также масштабировать жидкостные возможности до высокой пропускной способности с меньшим количеством дорогостоящих элементов управления (например, перистальтических насосов). Наконец, мы надеемся включить платформу автоматического отбора проб, которая будет использовать эти миллифлюидные и самодельные компоненты, преодолевая ограничение ручного взаимодействия во время более длительных и крупных экспериментов, когда отбор культур был бы громоздким.

Помимо физических модификаций платформы, веб-программное обеспечение открывает новые степени свободы, позволяя пользователям писать, редактировать и обмениваться пользовательскими сценариями eVOLVER, создавая полностью автоматизированные программы культур с обратной связью (например, турбидостат). Пользователи могут программно перемещаться по диапазонам параметров в тонких вариациях одной и той же схемы выбора или подключать алгоритмы управления в новых комбинациях, чтобы указать любое количество сложных схем выбора. Кроме того, возможность легко отслеживать культуры в режиме реального времени меняет способ проведения экспериментов.С помощью мониторинга в режиме реального времени пользователи могут 1) проверять согласованность между запусками, что является критически важной функцией для приложений биопродукции и высокопроизводительных экспериментов, и 2) при необходимости вмешиваться во время экспериментов для устранения проблем со сложными штаммами, которые демонстрируют плохой рост или образование биопленки, или диагностировать ошибки пользователя (например, загрязнение). Наконец, благодаря тому, что несколько потоков данных собираются и интерпретируются в режиме реального времени для каждой отдельной культуры, eVOLVER генерирует данные с высокой плотностью, что может облегчить подходы машинного обучения для нового последующего анализа.

Помимо продемонстрированных применений для характеристики пригодности, выбора библиотеки и развития лаборатории, мы считаем, что ряд связанных областей созрели для внедрения в eVOLVER с интегрированной гидродинамикой. Эксперименты eVOLVER с образцами микробиома могут анализировать стабильность сообщества в контролируемой среде 31, 32 , исследовать состав микробиоты с использованием методов культивирования 33 или динамически смешивать виды для изучения экологической динамики колонизации или инвазии 34 , 35 .Многочисленные методы непрерывной направленной эволюции биомолекул также могут быть легко реализованы на устройстве 26, 36, 37 , что значительно увеличивает доступность и производительность этих систем. Возможность оптимизации условий выращивания, таких как состав среды, температура и штаммы, в динамическом, высокопроизводительном характере может помочь в усилиях по оптимизации для промышленных приложений биопроизводства 9 . Мы также предполагаем вертикальную интеграцию eVOLVER с другими методами анализа, такими как микроскопия и проточная цитометрия, в режиме замкнутого цикла, обеспечивая полностью автоматизированную систему для роста и анализа клеточных культур как на уровне отдельных клеток, так и на уровне популяции.Более того, с некоторыми аппаратными модификациями Smart Sleeve, такими как герметизация сосуда и контроль содержания газа, eVOLVER потенциально может быть адаптирован для поддержки роста более широкого спектра типов клеток, таких как суспензионные клетки млекопитающих. Также возможно поместить весь каркас в анаэробную камеру для анаэробной культуры клеток. Заглядывая вперед, мы стремимся встроить нашу программную среду в централизованную облачную инфраструктуру и считаем, что это позволит пользователям легко настраивать, анализировать и обмениваться своими данными удаленно, без необходимости физического присутствия в лаборатории.Выполняя функции хранителя данных, облачная инфраструктура также позволяет проводить крупномасштабный метаанализ экспериментов. Мы ожидаем, что eVOLVER и эти будущие достижения значительно расширят масштаб возможных экспериментов по отбору роста, облегчая автоматизацию и инновации в непрерывной культуре.

БЛАГОДАРНОСТЬ:

Мы благодарим Б. Стаффорда за его помощь в разработке системы, а также Х. Халила, А. Солтанианзаде, А. Сан, С. Пайп и А. Кавале за помощь в создании системы.Мы выражаем признательность Центру проектирования электроники (EDF), Центру инноваций инженерных продуктов (EPIC) и Лаборатории инноваций программного обеспечения и приложений (SAIL) Института вычислительной техники Харири Бостонского университета за их услуги. Эта работа была поддержана премией NSF CAREER Award (MCB-1350949 для ASK) и грантами DARPA HR0011–15-C-0091 и HR0011–18-2–0014 (для ASK). СПРОСИТЬ. также признает финансирование Премии директора NIH New Innovator Award (1DP2AI131083–01), Премии DARPA для молодых преподавателей (D16AP00142) и Экспедиций NSF в области вычислительной техники (CCF-1522074).

Сноски

РАСКРЫТИЯ:

Авторы, Брэндон Г. Вонг и Ахмад С. Халил, являются соучредителями Fynch Bioscience Inc., которая разрабатывает платформу eVOLVER, используемую в этой статье.

НОМЕР:

1. Моно J Рост бактериальных культур. Ежегодный обзор микробиологии. doi: 10.1146/annurev.mi.03.100149.002103 (1949). [Перекрестная ссылка] [Академия Google]3. Бык АТ Ренессанс непрерывной культуры в постгеномную эпоху. Журнал промышленной микробиологии и биотехнологии.37 (10), 993–1021, doi: 10.1007/s10295-010-0816-4 (2010). [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Грешам Д., Данэм М.Дж. Непреходящая полезность непрерывного культивирования в экспериментальной эволюции. Геномика. 104 (6), 399–405, doi: 10.1016/J.YGEN0.2014.09.015 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Ланг Г.И. и другие. Распространенный генетический автостоп и клональная интерференция в сорока развивающихся популяциях дрожжей. Природа. 500 (7464), 571–574, doi: 10.1038/nature12344 (2013). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6.Маддамсетти Р. и другие. Адаптация, клональная интерференция и частотно-зависимые взаимодействия в долгосрочном эволюционном эксперименте с Escherichia coli. Генетика. 200 (2), 619–31, doi: 10.1534/genetics.115.176677 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7. Исии Н. и другие. Многочисленные высокопроизводительные анализы контролируют реакцию кишечной палочки на возмущения. Наука. 316 (5824), 593–597, doi: 10.1126/science.1132067 (2007). [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Брауэр М.Дж. и другие. Координация скорости роста, клеточного цикла, реакции на стресс и метаболической активности дрожжей.Молекулярная биология клетки. 19 (1), 352–367, doi: 10.1091/mbc.e07-08-0779 (2008). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Мозер Ф и другие. Работа генетической схемы в условиях, характерных для промышленных биореакторов. Синтетическая биология АСУ. 1 (11), 555–64, doi: 10.1021/sb3000832 (2012). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]10. Као Кей Си, Шерлок Джи Молекулярная характеристика клональной интерференции во время адаптивной эволюции бесполых популяций Saccharomyces cerevisiae.Генетика природы. 40 (12), 1499–1504, doi: 10.1038/ng.280 (2008). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]11. Топрак Э., Верес А., Мишель Дж.-Б., Чайт Р., Хартл Д.Л., Кишони Р. Эволюционные пути к антибиотикорезистентности в условиях динамично поддерживаемого лекарственного отбора. Генетика природы. 44 (1), 101–105, doi: 10.1038/ng.1034 (2011). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]12. Хоуп Э.А., Аморози С.Дж., Миллер А.В., Данг К., Хейл К.С., Данхэм М.Дж. Экспериментальная эволюция выявляет предпочтительные адаптивные пути к агрегации клеток в дрожжах.Генетика. 206 (2), 1153–1167, doi: 10.1534/genetics.116.198895 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Миллер А.В., Бефорт С., Керр Э.О., Данэм М.Дж. Дизайн и использование мультиплексных массивов хемостатов. Журнал визуализированных экспериментов. (72), 2–7, doi: 10.3791/50262 (2013). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Такахаши К.Н., Миллер А.В., Экнесс Ф., Данэм М.Дж., Клавинс Э. Недорогой настраиваемый турбидостат для использования в синтетических характеристиках контуров. Синтетическая биология ACS.4 (1), 32–38, doi: 10.1021/sb500165g (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]15. Топрак Э и другие. Создание морбидостата: автоматизированное устройство непрерывного культивирования для изучения устойчивости бактерий к лекарственным средствам при динамическом устойчивом ингибировании лекарственными препаратами. Протоколы о природе. 8 (3), 555–567, doi: 10.1038/nprot.nprot.2013.021 (2013). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]16. Вонг Б.Г., Манкузо С.П., Кириаков С., Башор С.Дж., Халил А.С. Точный автоматический контроль условий для высокопроизводительного роста дрожжей и бактерий с помощью eVOLVER.Природная биотехнология. 36 (7), 614–623, doi: 10.1038/nbt.4151 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]17. Бонди АБ, Б. А. Характеристики масштабируемости и их влияние на производительность. Материалы второго международного семинара по программному обеспечению и производительности — WOSP’00 195–203, doi: 10.1145/350391.350432 (2000). [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 19. Санчес М.Р. и другие. Дифференциальное расхождение паралогов модулирует эволюцию генома у разных видов дрожжей. ПЛОС Генетика. 13 (2), e1006585, doi: 10.1371/journal.pgen.1006585 (2017). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Гибни П.А., Лу К., Коди А.А., Хесс Д.К., Ботштейн Д. Метаболические и сигнальные гены дрожжей необходимы для выживания при тепловом шоке и мало перекрываются с генами, индуцированными теплом. Труды Национальной академии наук. 110 (46), E4393–E4402, doi: 10.1073/pnas.1318100110 (2013). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]21. Гиавер Г. и другие. Функциональное профилирование генома Saccharomyces cerevisiae.Природа. 418 (6896), 387–391, doi: 10.1038/nature00935 (2002). [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Пайпер МДВ и другие. Воспроизводимость анализа транскриптома микрочипа олигонуклеотидов. Межлабораторное сравнение с использованием хемостатных культур Saccharomyces cerevisiae. Журнал биологической химии. 277 (40), 37001–37008, doi: 10.1074/jbc.M2044

(2002). [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Бадаринараяна V и другие. Селекционный анализ инсерционных мутантов с использованием массивов субгенного разрешения.Природная биотехнология. 19 (11), 1060–1065, doi: 10.1038/nbt1101-1060 (2001). [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Дай Дж., Хайленд Э.М., Юань Д.С., Хуан Х., Бадер Дж.С., Боке Дж.Д. Зондирование функции нуклеосом: очень универсальная библиотека синтетических мутантов гистонов h4 и h5. Клетка. 134 (6), 1066–1078, doi: 10.1016/J.CELL.2008.07.019 (2008). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]25. МакГичи А.М., Мичем З.А., Инголия Н. Доступный турбидостат с непрерывной культурой для объединенного анализа сложных библиотек.bioRxiv. 450536, doi: 10.110 = 50536 (2018). [PubMed] [Google Scholar] 27. Карлсон Дж. К., Бадран А. Х., Гуггиана-Нило Д. А., Лю Д. Р. Отрицательный отбор и модуляция жесткости в непрерывной эволюции с помощью фагов. Химическая биология природы. 10 (3), 216–222, doi: 10.1038/nchembio.1453 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Милиас-Аргейтис А., Руллан М., Аоки С.К., Бухманн П., Хаммаш М. Автоматизированный оптогенетический контроль с обратной связью для точной и надежной регуляции экспрессии генов и роста клеток.Связь с природой. 7 (май), 12546, doi: 10.1038/ncomms12546 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]29. Венгер Дж.В., Пиотровски Дж., Нагараджан С., Киотти К., Шерлок Г., Розенцвейг Ф. Художники голода: дрожжи, адаптированные к ограничению выбросов углерода, показывают компромиссы при достаточности углерода. Генетика PLoS. 7 (8), e1002202, doi: 10.1371/journal.pgen.1002202 (2011). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]30. Йона АХ и другие. Хромосомная дупликация — временное эволюционное решение проблемы стресса.Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 109 (51), 21010–5, doi: 10.1073/pnas.1211150109 (2012). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Auchtung JM, Robinson CD, Britton RA Культивирование стабильных, воспроизводимых микробных сообществ от различных фекальных доноров с использованием массивов минибиореакторов (MBRA). Микробиом. 3, 42, doi: 10.1186/s40168-015-0106-5 (2015). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33. Лажье Ж.-К., Дюбур Г., Миллион М., Кадоре Ф., Фурнье П. Культивирование микробиоты человека и культуромика.Природа Обзоры микробиологии. 16 (сентябрь), 540–550, doi: 10.1038/s41579-018-0041-0 (2018). [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Фуками Т Исторические непредвиденные обстоятельства в собрании сообщества: интеграция ниш, видовых пулов и приоритетных эффектов. Ежегодный обзор экологии, эволюции и систематики. 46 (1), 1–23, doi: 10.1146/annurev-ecolsys-110411-160340 (2015). [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 35. Фридман Дж., Гор Дж. Биология экологических систем: динамика взаимодействующих популяций. Текущее мнение в системной биологии.1, 114–121, doi: 10.1016/j.coisb.2016.12.001 (2017). [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 36. Крук Н., Абатемарко Дж., Сан Дж., Вагнер Дж. М., Шмитц А., Альпер Х.С. In vivo непрерывная эволюция генов и путей у дрожжей. Связь с природой. 7, 13051, doi: 10.1038/ncomms13051 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]37. Равикумар А и другие. Масштабируемая непрерывная эволюция генов со скоростью мутаций выше порога геномной ошибки Масштабируемая непрерывная эволюция генов со скоростью мутации выше порога геномной ошибки.Клетка. 175, doi: 10.1016/j.cell.2018.10.021 (2018). [Статья без PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Эпитоп-специфическая вакцина на основе наночастиц с определенным химическим составом для респираторно-синцитиального вируса

Синтез пептидов

Пептиды были синтезированы твердофазным синтезом пептидов с использованием Fmoc-химии и амида Ринка. смола с использованием ранее опубликованных процедур 18,19,32 . Для синтеза FsIIm завершенную пептидную цепь ацетилировали на N-конце перед отщеплением от смолы и удалением защитных групп боковой цепи путем обработки трифторуксусной кислотой (ТФУ), тиоанизолом, H 2 O, этандитиол (87.5:5:5:2,5) в течение 2,5 ч. Пептид осаждали и промывали i Pr 2 O. Для окисления восстановленный пептид растворяли в 0,33 М аммиачно-бикарбонатном буфере, рН 7,8, и перемешивали на воздухе в течение ночи. Пептид очищали с помощью обращенно-фазовой (ОФ)-ВЭЖХ на препаративной колонке С18 и лиофилизировали с получением белого порошка. Аналитическая ОФ-ВЭЖХ (колонка Vydac 218TP54, 5 мкм, 4,6 мм х 250 мм, 0–60% MeCN в H 2 O (+0,1% ТФУ) в течение 40 мин): чистота: 90,4%; т Р  = 25.07 мин. ESI-MS: масса рассчитана для C 135 H 227 N 43 O 49 S 4 : 3349,52; m/z [M + 3H] 3+ 1117,51.

Для синтеза V-306 N-гидроксисукцинимидный эфир бис-Boc-аминооксиуксусной кислоты (Boc 2 -Aoa-OSu) присоединяли к N-концу пептидной цепи. Удаление из смолы, снятие защиты и окисление с получением V-306p были такими же, как описано выше для FsIIm (дополнительный рисунок 2). Сшитый дисульфидом пептид затем очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ на препаративной колонке С18 и лиофилизировали с получением белого порошка.Аналитическая ОФ-ВЭЖХ (Waters BEH C 8 , 1,7 мкм, колонка 2,1 × 150 мм, 10–50% MeCN в H 2 O (+0,05 % ТФУ) в течение 45 мин, 0,2 мл/мин, 30 ): чистота: 92,8%; t R  = 29,95 мин. ESI-MS: Масса рассчитана для C 135 H 230 N 44 O 49 S 4 : 3379,57  Да; m/z [M + H] + : 3380,60 Да (±0,3%).

Линкер был получен путем первой реакции эфира N-гидроксисукцинимидил-([N-малеимидопропионамидо]-гексаэтиленгликоля (SM-PEG 6 , Thermo Fisher Scientific) с диметилацеталем аминоацетальдегида (Aldrich) в H 2 O.SM-PEG 6 (7,6 мг, 12,6 мкмоль) суспендировали в H 2 O (0,3 мл) и растворе диметилацеталя аминоацетальдегида в H 2 O (17 мкл 1:10 (об./об.) )) был добавлен. Смесь перемешивали в течение 90 мин при комнатной температуре. Продукт очищали ОФ-ВЭЖХ на колонке С8 и лиофилизировали. Аналитическая ОФ-ВЭЖХ Waters BEH C 8 , 150 × 2,1 мм, 1,7 мкм, 0–20% MeCN в H 2 O (+0,05% муравьиной кислоты) в течение 20 мин, 0,4 мл/мин, 40 °C: чистота 94,6%, т R  = 14.29 мин. ESI-MS: масса моноизотопа C 26 H 45 N 3 O 12 : 591,30 Да; [M + H] + найдено: 591,62 Да (±0,1%). Непосредственно перед конъюгацией гидролиз диметилацеталя проводили с 95% TFA, 5% H 2 O в течение 5 мин. TFA удаляли в вакууме с получением линкера. ESI-MS C 24 H 39 N 3 O 11 : 545,26 Да; [M + H] + найдено: 545,28 Да (±0,05%).

Липопептид был синтезирован и очищен с помощью ОФ-ВЭЖХ, как описано в другом месте 18,19,20,21 .Аналитическая ОФ-ВЭЖХ Waters BEH C 8 , 150 × 2,1 мм, 1,7 мкм, 64–91% MeOH в H 2 O (+0,05% TFA) в течение 37,5 мин, 0,4 мл/мин, чистота: 70 °C 97,0%, t R  = 21,80 мин. ESI-MS: моноизотопная масса C 312 H 552 N 74 O 89 S 3: 6856,0 Да; m/z [M + H] + найдено 6860,0 Да (±0,05%).

Для приготовления V-306 раствор пептида V-306p (12 мг, 3,6 мкмоль) в 0,25 мл 0,1 М буфера ацетата натрия, рН 3.5 добавляли к линкеру (3,8 мг, 7,2 мкмоль) в 0,25 мл 0,1 М буфера ацетата натрия, рН 3,5. Смесь перемешивали в течение 2,5 ч, и оксим продукта (названный VMX-3067, дополнительная рис. 2) очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ на препаративной колонке C8. Аналитическая СЭЖХ (Waters BEH C 8 , 1,7 мкм, 2,1 ×150 мм, от 10 до 40% MeCN в H 2 O (+0,05% муравьиной кислоты) в течение 37,5 мин, 0,4 мл/мин, чистота: 26°C 95%, t R  = 21,5 мин ESI-MS: масса рассчитана для C 158 H 263 N 47 O 59 6 9 9 S 9032 Да; m/z [M + H] + найдено 3893,48 (±0,3%). Оксим (4,0 мг, 1,0 мкмоль) растворяли в 0,5 мл H 2 O и добавляли к раствору липопептида (6,2 мг, 0,9 мкмоль) в 2 мл 50% MeCN. pH доводили до pH = 6,5 с помощью 0,1 N NaOH/0,1 N HCl, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов. Конъюгат V-306 очищали ОФ-ВЭЖХ на колонке С8. Соль TFA сначала превращали в ацетатную соль, а затем в гидрохлоридную соль с использованием анионообменной смолы AG-X2. Конъюгат анализировали с помощью аналитической УЭЖХ и МС (дополнительная фиг.3). UPLC (Waters BEH C8, 1,7 мкм, 2,1 × 150 мм) с содержанием MeCN от 20 до 80% в H 2 O (+0,03% TFA) в течение 60 мин, 26 °C: чистота 90%, t R = 51,5 мин. ESI-MS: расчет массы моноизотопа. для C 470 H 815 N 121 O 148 S 7 : 10746,9 Da; m/z [M + 13H] 13+ найдено 827,6875 Да (± 0,1%). Конъюгат V-306 суспендировали в PBS, уравновешивали в течение 30 минут, разбавляли до 1,0 мг/мл и анализировали с помощью DLS на приборе DynaPro Nanostar (Wyatt Technology) при 25 °C (дополнительная рис.4). Распределение по размеру с помощью регуляризационного анализа было мономодальным. Средний гидродинамический радиус (R h ) составлял ок. 13 нм, а показатель полидисперсности (Pd) 0,038.

Исследования ЯМР в растворе

1 Измерения H ЯМР FsIIm выполнены в H 2 O/D 2 O (9:1) или чистом D 2 O, pH 5,0, на Bruker AV- 600 спектрометра при 300 К. Спектральные присвоения были сделаны с использованием спектров 2D DQF-COSY, TOCSY (время смешивания 100 мс) и NOESY (время смешивания 250 мс) (см. Дополнительный рис.1). Спектры обычно собирались с 1024 × 256 комплексных точек данных, заполненных нулями до преобразования Фурье в 2048 × 1024 и преобразованных с помощью функции взвешивания косинус-колокола. 3 J Константы связи HNα определены из двумерных спектров NOESY методом обратного преобразования Фурье синфазных мультиплетов. Ограничения по расстоянию были получены из двумерных спектров NOESY. Дополнительные ограничения были введены для двух дисульфидных связей между остатками Cys4–Cys25 и Cys8–Cys21.Структурные расчеты были выполнены методом ограниченной молекулярной динамики в CYANA 34 с использованием ограничений по расстоянию, полученных из NOE, и ограничений по дисульфидным связям. Был выбран окончательный набор из 20 конформаций, которые имеют самую низкую целевую энергетическую функцию CYANA, показанную на рис. 1b (см. Также дополнительный рисунок 1).

Исследования на животных

Исследования на животных проводились в Sigmovir Biosystems Inc. (MD, США). Животных содержали в больших поликарбонатных клетках и кормили стандартным кормом для грызунов и водой.Колонию контролировали на наличие антител к адвентивным респираторным вирусам и другим распространенным возбудителям грызунов, и такие антитела не были обнаружены. Все исследования проводились в соответствии с применимыми законами и руководствами и после одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Sigmovir Biosystems, Inc. (MD, USA). Производство поликлональных и моноклональных антител осуществлялось в компании Eurogentec SA (Бельгия). Помещения для животных аккредитованы бельгийскими властями. Объекты соответствуют самым высоким стандартам благополучия животных, в том числе аккредитованы FELASA (Федерация европейских лабораторных животных), BELAC (Бельгия) и Законом о научных процедурах Министерства внутренних дел Великобритании, а также в соответствии с ISO 13485 для in vitro. производство мАТ.

Иммунизация

Для анализа ответов антител 6-8-недельных самок мышей BALB/c (пять-шесть на группу) или новозеландских белых кроликов (два на группу) иммунизировали антигеном, растворенным в PBS (100 мкл для мышей, 400 мкл для кроликов). Контрольных животных иммунизировали PBS (носитель), инактивированным формалином RSV (FI-RSV) или живым RSV A2 (10 5 БОЕ). Собирали кровь и анализировали сыворотку с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и анализов nAb RSV (тест 60% PRNT и MN) на nAb против штаммов RSV A2.

Мышиное mAb 10D11 было изготовлено компанией Eurogentec (Бельгия) с использованием V-306 в качестве иммуногена. Клетки селезенки иммунизированных мышей сливали с несекреторными клетками миеломы Sp2/0Ag14 (ATCC ® CRL8287™) в соотношении 5:1 в соответствии со способами Eurogentec (Бельгия). Супернатанты культур подвергали скринингу на анти-V-306p-антитело с помощью ELISA, а затем с помощью теста MN вируса RSV A Tracy. Положительные гибридомы дважды клонировали путем предельного разведения и размножали. Для крупномасштабного производства mAb клонированные гибридомные клеточные линии культивировали в суспензии в роллерных флаконах (Greiner, Бельгия), содержащих 650 мл среды, и mAb очищали с помощью высокоэффективной аффинной хроматографии с белком G (GE Healthcare, Бельгия).Очищенные mAb диализовали против PBS, стерильно фильтровали и хранили при -80 °C.

ELISA

ELISA проводили на 96-луночных микротитрационных планшетах MaxiSorp (Nunc, Fischer Scientific), которые покрывали при 4 °C в течение ночи растворами 5 мкл/мл пептида V-306p в PBS, pH 7,2 в 50 мМ карбонатно-натриевый буфер. Лунки промывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBST), и блокировали PBS, содержащим 5% сухого обезжиренного молока, на 1 ч при комнатной температуре. После блокировки лунки трижды промывали ФСБТ и инкубировали с серийными четырехкратными разведениями сыворотки мышей в ФСБ, содержащем О.05% Tween-20 и 0,5% сухого обезжиренного молока (MPBST) в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего три раза промывали PBST. Затем планшеты инкубировали с HRP-конъюгированным козьим антимышиным IgG (Sigma, Сент-Луис, Миссури), разводили 1:15 000 в MPBST в течение 1 часа при комнатной температуре, снова трижды промывали PBST и инкубировали в темноте с Раствор 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ) (Sigma) в течение 15 мин. Цветную реакцию останавливали добавлением 0,16 M H 2 SO 4 и считывали оптическую плотность в лунках при 450 нм на планшет-ридере.Конечные титры определяли как максимальное разведение, дающее значение OD в два раза больше, чем у буфера. Титры IgG также рассчитывали как обратные разведения сыворотки, соответствующие полумаксимальным концентрациям связывания (EC 50 ). Данные анализировали с использованием GraphPad Prism с использованием нелинейной регрессии для расчета конечных титров.

Конкурентный ИФА для определения антител, конкурирующих с паливизумабом, выполняли, в основном, как описано выше, за исключением того, что вместо четырехкратных разведений сыворотки применяли серийно двукратно разведенные (от 1:20 до 1:2560) сыворотки иммунизированных или не получавших ранее контрольных мышей, предварительно смешанные с константным в планшеты добавляли 50 нг/мл паливизумаба в MPBST.Затем планшеты обрабатывали и считывали, как описано выше. Титры конкурирующих с паливизумабом антител, выраженные как IC 50 , рассчитывали с помощью GraphPad Prism 6.

Количественное определение паливизумаб-подобных антител в сыворотке крови человека Университетская клиника, Бельгия, на основе методов, описанных выше. Вкратце, 96-луночные полистироловые планшеты покрывали носителем SVLP, пептидом V-306p или антигеном SVLP V-306.Носитель SVLP не распознавался ни паливизумабом, ни антителами в сыворотке крови человека. Затем добавляли 8 двукратных серийных разведений сыворотки крови человека. После промывания добавляли mAb-HRP против Fc IgG человека (разведение 1/120000). После промывки добавляли субстрат TMB. Цветную реакцию останавливали добавлением 1 н. серной кислоты. Через 30 мин считывают OD. Оптическую плотность для данного образца использовали для экстраполяции титра антител, выраженного в мкг/мл. Условия покрытия были оптимизированы с использованием обедненной IgG сыворотки человека с добавлением известных концентраций паливизумаба таким образом, чтобы не наблюдалось дальнейшего увеличения сигнала (точка насыщения) и не наблюдалось значительного сигнала в отрицательном контроле.Чувствительность анализа определяли с использованием различных концентраций паливизумаба (от 0 до 200 мкг/мл) и антител, конъюгированных с человеческим IgG HRP (см. Дополнительный рисунок 5). Предел обнаружения составил 0,012207 мкг/мл паливизумаба (0,61 мкг/мл в сыворотке человека, разбавленной 1/50). Концентрации паливизумаб-подобных антител, обнаруженные в 20 различных сыворотках крови человека (образцы сыворотки 001–020), показаны на дополнительном рисунке 5. выполнено в Sigmovir Biosystems Inc.(MD, США), как описано ранее

35 . Вкратце, для анализа антител, нейтрализующих RSV (тест нейтрализации 60% уменьшения бляшек (PRNT)), сыворотку инактивировали нагреванием в течение 30 мин. при 56 °C, разбавляли 1:10 минимальной основной средой Игла (EMEM) и серийно разбавляли еще 1:4. Разведенные образцы сыворотки инкубировали с равными объемами RSV/A2 (25–50 БОЕ) в течение 1 часа при комнатной температуре и инокулировали в двух повторностях на конфлюэнтные монослои HEp-2 в 24-луночных планшетах. После 1 ч инкубации при 37°С в инкубаторе с 5% CO 2 лунки покрывали 0.Среда 75% метилцеллюлоза. Через 4 дня инкубации покрытия удаляли, клетки фиксировали и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение часа, затем промывали и сушили на воздухе. Соответствующие реципрокные титры nAb определяют в конечной точке снижения вируса на 60% с использованием статистической программы «plqrd.manual.entry». Были рассчитаны средние геометрические ± стандартная ошибка для всех образцов в группе в данный момент времени.

Нейтрализующие антитела у кроликов

Один новозеландский белый кролик был иммунизирован V-306 (150  мкг, растворенный в PBS) и ревакцинирован на 28 и 56 дни.Сыворотку собирали на 66-й день. Анализы nAb проводили в лаборатории доктора Мартина Мура в Университете Эмори, США. Была создана панель меченных mKate2 химерных вирусов RSV, содержащих белки F и G пяти штаммов A и трех штаммов B, как описано ранее 35,36,37 . Для анализов готовили 96-луночные планшеты с клетками НЕр-2. Образцы сыворотки инактивировали нагреванием при 56°С в течение 30 мин. Разведения сыворотки каждого вируса из клинической панели готовили в PBS, затем добавляли к разбавленной сыворотке и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.Образец смеси вирус/сыворотка переносили на планшет HEp-2 и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. В каждую лунку добавляли раствор 0,75% метилцеллюлозы, растворенной в МЕМ, и планшеты инкубировали при 37°С в течение 48 ч перед подсчетом БОЕ на лунку. Количество FFU, подсчитанное во внутренних повторах, усреднялось. Макс. количество подсчитанных БОЕ принимали за 0% и 0 БОЕ принимали за 100% нейтрализацию. Для анализа данных использовали GraphPad Prism. Подгонка кривой была проведена с помощью нелинейного регрессионного анализа, и EC 50 была построена с верхней границей 95% доверительного интервала (рис.3с).

RSV-нейтрализующие антитела с помощью анализа микронейтрализации

Анализ RSV A Tracy MN был проведен профессором Педро Пьедра из Медицинского колледжа Бейлора, Техас, США. Образцы сыворотки, инактивированные нагреванием, анализировали на наличие nAb против RSV A/Tracy в клетках HEp-2 с использованием квалифицированных анализов MN, как описано ранее 38,39,40,41 . Титры nAb определяли как конечное разведение, при котором наблюдалось 50% снижение вирусного цитопатического эффекта. Любой образец сыворотки, дающий титр ниже нижнего предела обнаружения (LOD) (2.5 log2) было присвоено значение 2 log2.

Заражение RSV у мышей

Эксперименты по заражению проводились в Sigmovir Biosystems Inc. (MD, США), как описано ранее 35 . Для определения защиты от заражения группы из шести мышей иммунизировали 150 мкг V-306 в 0,1 мл PBS подкожно, как описано выше. Контрольные группы иммунизировали внутримышечно FI-RSV или PBS. Через двадцать один день после последней иммунизации животных интраназально заражали 50 мкл RSV A2 в концентрации 10 ± БОЕ на животное.Через пять дней после контрольного заражения животных подвергали эвтаназии, окончательно брали кровь для определения нейтрализующих антител с помощью 60% PRNT, как описано выше, и легкие собирали и разделяли пополам для титрования вируса и гистопатологического анализа.

Для титрования вирусов гомогенаты легких очищали центрифугированием и разводили в EMEM. Конфлюэнтные монослои HEp-2 инфицировали в двух повторностях разбавленными гомогенатами в 24-луночных планшетах. После 1 ч инкубации при 37°С в инкубаторе с 5% CO 2 лунки покрывали 0.Среда 75% метилцеллюлоза. Через 4 дня инкубации накладки удаляли, клетки фиксировали и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 1 ч, затем промывали и сушили на воздухе. Бляшки подсчитывали и титры вируса выражали в виде бляшкообразующих единиц на грамм ткани. Неопределяемый вирус выражался как <2,30 log 10 БОЕ/грамм.

Легочная гистопатология у мышей

Легочная гистопатология была проведена в Sigmovir Biosystems Inc. (MD, США), как описано ранее 35,42 .Вкратце, для легочной гистопатологии легкие собирали и оценивали для гистопатологии, как описано в другом месте 26 . Легкие рассекали и надували 10% нейтральным забуференным формалином до их нормального объема, а затем погружали в тот же фиксирующий раствор. После фиксации легкие заливают парафином, делают срезы и окрашивают гематоксилином и эозином (дополнительная рис. 6). Оцениваются четыре параметра легочного воспаления: перибронхиолит (воспалительная клеточная инфильтрация вокруг бронхиол), периваскулит (воспалительная клеточная инфильтрация вокруг мелких кровеносных сосудов), интерстициальная пневмония (воспалительная клеточная инфильтрация и утолщение альвеолярных стенок) и альвеолит (клетки внутри альвеолярного пространства).Каждый параметр оценивался отдельно для каждого гистопатологического среза с максимальным значением 4 и минимальным значением 0 26 . Впоследствии баллы были преобразованы в шкалу гистопатологии 0–100%.

Сравнение пассивного переноса 10D11 и паливизумаба

Испытательное исследование по сравнению 10D11 и паливизумаба было проведено в Sigmovir Biosystems Inc. (MD, США). Молодым взрослым самцам хлопчатобумажных крыс (возраст 8, 6–8 недель) вводили внутримышечно mAb (в дозах 1,0, 2,5, 5,0 или 15 мг). Всех животных заражали 100 мкл RSV/A2 в концентрации 10 5 БОЕ на животное.После умерщвления животных ткань носа и легких собирали для титрования вируса с использованием анализа RSV/A2 60% PRNT, описанного выше.

Эксперименты BIAcore

Эти измерения были выполнены доктором Йенсом Собеком в Центре функциональной геномики Университета и ETH Zurich. Связывание FsIIm как с 10D11, так и с паливизумабом измеряли с использованием прибора T200 BIAcore (Cytiva USA, ранее GE Healthcare). mAb захватили на сенсорном чипе CM5 с использованием коммерческого набора для захвата mAb (Cytiva USA), разработанного для mAb мыши или человека, в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем.Захватывающее антитело было иммобилизовано стандартным аминовым связыванием и связывается с эпитопом во всех классах домена Ch3 Fc IgG. Сенсограммы (дополнительная рис. 8) были оценены с использованием программного обеспечения для оценки BIA 3.1, с использованием кинетического анализа для связывания 1: 1 для 10D11 и термодинамического анализа для паливизумаба, каждый в буфере HBS (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ). ЭДТА, 0,005% Tween-20 (полисорбат 20), pH 7,4) при скорости потока 30 мкл/мин и 20 °C.

Сводка отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Сводке отчета об исследовании природы, связанной с этой статьей.

Калибровочные материалы для рефрактометров и поляриметров

АГ жидкости

AG Fluids представляют собой водные растворы с диапазоном RI 1,33–1,40 (эквивалент 0–40 °Brix) и сроком годности 12 месяцев. Они идеально подходят для калибровки рефрактометров с контролем температуры как в пищевой промышленности, так и в промышленности, а также приборов с температурной компенсацией AG Fluid, таких как цифровые ручные рефрактометры OPTi и рефрактометры серии RFM700.Будучи водными, они безопасны и просты в использовании, а также обеспечивают отличную отслеживаемость. AG Fluids уникальны, так как они имеют низкое значение Брикса, длительный срок хранения и сертифицированы UKAS, подтверждая прослеживаемость до ICUMSA и NIST. AG Fluids можно приобрести в Refractometer Shop, интернет-магазине Bellingham + Stanley для портативных рефрактометров и калибровочных жидкостей для рефрактометров. Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Калибровочные масла

Калибровочные масла

представляют собой органические соединения, охватывающие диапазон 1.46 -1,56 РИ и закройте верхний конец шкалы Брикса. Калибровочные масла имеют срок годности 12 месяцев. Они идеально подходят для калибровки рефрактометров с контролем температуры как в пищевой промышленности, так и в промышленности. Имея RI выше 1,54 RI, BSDD идеально подходит для производителей химической продукции, работающих выше обычной шкалы Брикса. Калибровочные масла поставляются с сертификатом UKAS, подтверждающим прослеживаемость до ICUMSA и NIST. Калибровочные масла можно приобрести в Refractometer Shop, интернет-магазине Bellingham + Stanley для портативных рефрактометров и калибровочных жидкостей для рефрактометров. Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Австралия 32

Стандарты

AUS 32 представляют собой уникальные растворы, эквивалентные рефрактометру, специально откалиброванные для сертификации рефрактометров, работающих с водными растворами мочевины (AUS), иногда известными как DEF (жидкости для выхлопных газов дизельных двигателей). Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Дистиллированная вода

Вода является наиболее часто используемым образцом для калибровки нуля. Доступен во флаконе объемом 15 мл с сертификатом производителя, подтверждающим прослеживаемость до NIST.Сертифицированная вода обычно используется при валидации критически важных приборов, таких как те, которые используются в фармацевтической промышленности. Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Растворы сахарозы

Растворы сахарозы

упрощают использование при калибровке приборов, в которых нет температурного контроля, но используется температурная компенсация. Их также предпочитают производители напитков, сахара и продуктов питания, поскольку их компоненты обычно соответствуют тестируемому продукту.Однако Sucrose Solutions имеют короткий срок годности, поэтому клиенты, как правило, выбирают контракт на поставку, чтобы обеспечить регулярные поставки с минимальными логистическими затратами. Растворы сахарозы доступны с рядом значений, охватывающих диапазон 0–60 °Brix, и поставляются с сертификатом производителя, подтверждающим соответствие требованиям ICUMSA и NIST. Растворы сахарозы можно приобрести в Refractometer Shop, интернет-магазине Bellingham + Stanley для портативных рефрактометров и калибровочных жидкостей для рефрактометров. Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Пластины RI

Твердые тестовые пластины

иногда используются для калибровки рефрактометров, когда жидкие образцы не идеальны или когда тип прибора диктует их использование. Из-за их низкой точности Bellingham + Stanley предоставляет сертификат проверки в месте заказа для всех планшетов и предлагает повторную сертификацию только для тестовых планшетов для кремнезема. Сертификаты проверки не подпадают под действие UKAS, поэтому клиенты, которым требуется более высокий уровень обслуживания, должны использовать жидкие эталонные материалы.Тестовые пластины для рефрактометров можно приобрести в магазине рефрактометров, онлайн-магазине Bellingham + Stanley для портативных рефрактометров и калибровочных жидкостей для рефрактометров. Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Пакеты проверки CRM

Комплекты верификации

включают в себя различные жидкости AG и калибровочные масла. Они идеально подходят для проверки лабораторных рефрактометров любого производителя, где требуется проверка результатов во всем диапазоне измерений. Пакеты проверки поставляются с сертификатом калибровки UKAS для каждого элемента и демонстрируют прослеживаемость до ICUMSA и NIST.Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Кварцевые пластины поляриметра

Bellingham + Stanley предлагает выбор кварцевых контрольных пластин (QCP) для проверки и калибровки поляриметров. QCP изготовлены по самым высоким стандартам и могут поставляться с дополнительным сертификатом калибровки, подтверждающим прослеживаемость до PTB. При использовании с ADP-поляриметром производства Bellingham + Stanley можно использовать термоблок для обеспечения механического контакта с внешним датчиком температуры прибора, что позволяет использовать кварцевую температурную компенсацию для повышения точности.

В рамках надлежащей лабораторной практики рекомендуется отправлять кварцевые контрольные пластины в нашу лабораторию UKAS через регулярные промежутки времени, определяемые собственной стандартной рабочей процедурой пользователя, для проверки и повторной сертификации. Купите сейчас или свяжитесь с нами сегодня, чтобы найти дилера.

Сертифицированные эталонные материалы плотности

Эталонная жидкость для плотномера для проверки работы цифровых плотномеров, включая плотномер серии DSG от Bellingham + Stanley.Сертифицированная эталонная жидкость для плотномера поставляется в одноразовой герметичной стеклянной ампуле объемом 10 мл с ломающимся носиком для предотвращения загрязнения. Каждая покупка включает сертификат UKAS, паспорт безопасности (SDS) и поставляется в прочной алюминиевой тубе для защиты во время транспортировки и для безопасного хранения.

%PDF-1.6 % 914 0 объект > эндообъект 556 0 объект > эндообъект 911 0 объект >поток 2011-08-30T14:09:41-04:002011-08-10T14:00:10-04:002011-08-30T14:09:41-04:00ПО HP Smart Document Scan 2.70application/pdfuuid:ce7e1a09-23aa-4d36-9d4a-18888fbe234euuid:eaa7dc15-ae89-420a-aa11-38bf4c8bd07aOmniPage CSDK 16 конечный поток эндообъект 958 0 объект >/Кодировка>>>>> эндообъект 897 0 объект > эндообъект 749 0 объект > эндообъект 751 0 объект > эндообъект 1015 0 объект > эндообъект 937 0 объект >/CM75+1>/CM72+1>/CM5+10>/CM5+11>/CM5+12>/CM5+13>/CM5+14>/CM5+15>/CM5+16>/CM5+17 >/CM5+18>/CM5+19>/CM33+10>/CM33+11>/CM5+20>/CM5+21>/CM5+22>/CM5+23>/CM5+24>/CM5+25 >/CM38+1>/CM38+2>/CM38+3>/CM38+4>/CM38+5>/CM38+6>/CM38+7>/CM38+8>/CM38+9>/CM10++ 1>/CM10++2>/CM10++3>/CM10++4>/CM35+1>/CM10++5>/CM35+2>/CM10++6>/CM35+3>/CM35+ 4>/CM35+5>/CM35+6>/CM35+7>/CM35+8>/CM35+9>/CM32+1>/CM32+2>/CM32+3>/CM32+4>/CM32+ 5>/CM32+6>/CM32+7>/CM32+8>/CM18+10>/CM32+9>/CM18+11>/CM1+10>/CM18+12>/CM1+11 19029 0 R/ CM18+13>/CM1+12>/CM18+14>/CM1+13>/CM18+15>/CM1+14>/CM18+16>/CM1+15>/CM18+17>/CM1+16>/ CM1+17>/CM1+18>/CM1+19>/CM1+20>/CM1+21>/CM1+22>/CM67+1>/CM1+23>/CM67+2>/CM1+24>/ CM1+25>/CM1+26>/CM1+27>/CM64+1>/CM64+2>/CM61+1>/CM61+2>/CM14+10>/CM14+11>/CM14+12>/ CM14+13>/CM14+14>/CM14+15>/CM14+16>/CM14+17>/CM14+18>/CM14+19>/CM6++1>/CM6++2>/CM6++ 3>/CM6++4>/CM6++5>/CM6++6>/CM6++7>/CM3++10>/CM3++11>/CM3++12>/CM27+1>/ CM27+2>/CM27+3>/CM27+4>/CM27+5>/CM27+6>/CM27+7>/CM27+8>/CM27+9>/CM24+1 18989 0 R/CM24+2 >/CM24+3>/CM24+4>/CM24+5> /CM24+6>/CM24+7>/CM24+8>/CM24+9>/CM21+1 18986 0 R/CM21+2>/CM26+10>/CM21+3>/CM26+11>/CM21+ 4>/CM26+12>/CM21+5>/CM26+13>/CM21+6>/CM26+14>/CM21+7>/CM26+15>/CM21+8>/CM26+16>/CM21+ 9>/CM26+17>/CM10+10>/CM10+11>/CM10+12>/CM10+13>/CM10+14>/CM10+15>/CM10+16>/CM10+17>/CM10+ 18>/CM2++1>/CM10+19>/CM59+1>/CM2++2>/CM59+2>/CM2++3>/CM2++4>/CM2++5>/CM2+ +6>/CM2++7>/CM2++8>/CM2++9>/CM56+1>/CM56+2>/CM10+20>/CM10+21>/CM10+22>/CM10+23 >/CM10+24>/CM10+25>/CM53+1>/CM53+2>/CM53+3>/CM53+4>/CM50+1>/CM50+2>/CM50+3>/CM50+4 >/CM50+5>/CM50+6>/CM22+10>/CM22+11>/CM22+12>/CM22+13>/CM22+14>/CM22+15>/CM22+16>/CM22+17 >/CM22+18>/CM22+19>/CM15++1>/CM15++2>/CM19+1 18984 0 R/CM19+2>/CM19+3>/CM19+4>/CM19+5> /CM19+6>/CM19+7>/CM8+1>/CM19+8>/CM8+2>/CM19+9>/CM8+3>/CM8+4>/CM8+5>/CM8+6> /CM8+7 19036 0 R/CM8+8>/CM16+1>/CM8+9>/CM16+2>/CM16+3 18981 0 R/CM16+4>/CM16+5>/CM16+6>/ CM16+7>/CM5+1>/CM16+8>/CM5+2>/CM16+9>/CM5+3>/CM5+4 2279 0 R/CM6+10>/CM5+5>/CM6+11 >/CM5+6>/CM6+12>/CM5+7>/CM6+13>/CM5+8 19033 0 R/CM13+1>/CM6+14>/CM5+9>/CM13+2>/CM6 +15>/ CM13+3>/CM6+16>/CM13+4 18980 0 R/CM6+17>/CM13+5>/CM6+18>/CM13+6>/CM6+19>/CM13+7>/CM2+1 >/CM13+8>/CM2+2>/CM13+9>/CM2+3>/CM2+4>/CM2+5 2276 0 R/CM34+10>/CM2+6>/CM34+11>/CM2 +7>/CM34+12>/CM2+8>/CM34+13>/CM10+1>/CM2+9>/CM10+2>/CM10+3>/CM10+4>/CM10+5>/CM10 +6>/CM10+7 18977 0 R/CM10+8>/CM10+9>/CM5++10>/CM5++11>/CM6+20>/CM6+21>/CM6+22>/CM6+ 23>/CM6+24>/CM6+25>/CM6+26>/CM6+27>/CM48+1>/CM48+2>/CM48+3>/CM48+4>/CM48+5>/CM48+ 6>/CM11++1>/CM11++2>/CM11++3>/CM11++4>/CM45+1>/CM11++5>/CM45+2>/CM45+3>/CM45+ 4>/CM45+5>/CM45+6>/CM45+7>/CM42+1>/CM42+2>/CM42+3>/CM42+4>/CM42+5>/CM42+6>/CM42+ 7>/CM42+8>/CM19+10>/CM19+11>/CM2+10 19030 0 R/CM19+12>/CM2+11>/CM19+13>/CM2+12>/CM19+14>/ CM2+13>/CM19+15>/CM2+14>/CM19+16>/CM2+15>/CM19+17>/CM2+16>/CM19+18>/CM2+17>/CM19+19>/ CM2+18>/CM2+19>/CM30+10>/CM30+11>/CM30+12>/CM30+13>/CM30+14>/CM2+20>/CM2+21>/CM2+22>/ CM2+23>/CM77+1>/CM2+24>/CM2+25>/CM2+26>/CM2+27>/CM74+1>/CM71+1>/CM15+10>/CM15+11>/ CM15+12>/CM15+13>/CM15+14>/CM15+15>/CM15+16>/CM15+17>/CM15+18>/CM7++1>/CM7++2>/CM7++ 3>/СМ7 ++4>/CM7++5>/CM7++6>/CM37+1>/CM37+2>/CM37+3>/CM37+4>/CM37+5>/CM37+6>/CM37+7 >/CM37+8>/CM37+9>/CM34+1 18996 0 R/CM34+2>/CM34+3>/CM34+4>/CM34+5>/CM34+6>/CM34+7>/CM34 +8>/CM34+9>/CM31+1>/CM31+2>/CM27+10>/CM31+3>/CM27+11>/CM31+4>/CM27+12>/CM31+5>/CM27 +13>/CM31+6>/CM27+14>/CM31+7>/CM27+15>/CM31+8>/CM27+16>/CM31+9>/CM11+10>/CM11+11>/CM11 +12>/CM11+13>/CM11+14>/CM11+15>/CM11+16>/CM11+17>/CM11+18>/CM11+19>/CM3++1>/CM69+1>/ CM3++2>/CM3++3>/CM3++4>/CM3++5>/CM3++6>/CM3++7>/CM3++8>/CM3++9>/CM10> /CM11>/CM66+1>/CM12>/CM66+2>/CM13>/CM14>/CM15>/CM16>/CM17>/CM18>/CM19>/CM11+20>/CM11+21>/CM11+ 22>/CM11+23>/CM11+24>/CM11+25>/CM63+1>/CM63+2>/CM60+1>/CM60+2>/CM20>/CM21>/CM22>/CM23>/ CM24>/CM25>/CM26>/CM27>/CM28>/CM29>/CM23+10>/CM23+11>/CM23+12>/CM23+13>/CM23+14>/CM23+15>/CM23+ 16>/CM23+17>/CM23+18>/CM30>/CM31>/CM32 18995 0 R/CM33>/CM34>/CM16++1>/CM35 18997 0 R/CM16++2>/CM36 18998 0 R/CM37 18999 0 R/CM29+1>/CM38 19000 0 R/CM29+2>/CM39 19001 0 R/CM29+3>/CM29+4>/CM29+5>/CM29+6>/CM29+7 >/CM29+8>/CM29+9>/CM26+1>/CM26+2 >/CM26+3>/CM26+4>/CM26+5>/CM26+6>/CM26+7>/CM26+8>/CM26+9>/CM7+10>/CM7+11>/CM40 19002 0 R/CM7+12>/CM41 19003 0 R/CM7+13>/CM42 19004 0 R/CM7+14>/CM43 19005 0 R/CM23+1>/CM7+15>/CM44 19006 0 R/CM23+2 >/CM7+16>/CM45 19007 0 R/CM23+3>/CM7+17>/CM46 19008 0 R/CM23+4>/CM7+18>/CM47 19009 0 R/CM23+5>/CM7+19 >/CM48 19010 0 R/CM23+6>/CM49 19011 0 R/CM23+7>/CM23+8>/CM23+9>/CM20+1>/CM20+2>/CM20+3>/CM20+4 >/CM20+5>/CM20+6>/CM20+7>/CM20+8>/CM20+9>/CM7+20>/CM7+21>/CM50 19012 0 R/CM7+22>/CM51 19013 0 R/CM7+23>/CM52 19014 0 R/CM7+24>/CM53 19015 0 R/CM7+25>/CM54 19016 0 R/CM7+26>/CM55>/CM56 19017 0 R/CM57 19018 0 R/ CM58 19019 0 R/CM59 19020 0 R/CM58+1>/CM58+2>/CM12++1>/CM12++2>/CM12++3>/CM12++4>/CM55+1>/CM12 ++5>/CM55+2>/CM60 19021 0 R/CM61 19022 0 R/CM62 19023 0 R/CM63 19024 0 R/CM64 19025 0 R/CM65 19026 0 R/CM66 19027 0 R/CM67 19028 0 R/ CM68>/CM69>/CM52+1>/CM52+2>/CM52+3>/CM52+4>/CM3+10>/CM3+11>/CM3+12>/CM3+13>/CM3+14> /CM3+15>/CM3+16>/CM3+17>/CM3+18>/CM3+19>/CM70>/CM71>/CM31+10>/CM72>/CM31+11>/CM73>/CM31+ 12> /CM31+13>/CM74>/CM75>/CM76>/CM77>/CM78>/CM79>/CM2++10>/CM3+20>/CM2++11>/CM3+21>/CM2++12 >/CM3+22>/CM2++13>/CM3+23>/CM3+24>/CM2++14>/CM3+25>/CM2++15>/CM80>/CM81>/CM18+1> /CM82>/CM18+2>/CM83>/CM18+3>/CM84>/CM18+4>/CM18+5>/CM18+6>/CM7+1>/CM18+7>/CM7+2>/ CM18+8>/CM7+3>/CM18+9>/CM7+4>/CM7+5>/CM7+6>/CM7+7 19035 0 R/CM7+8>/CM7+9>/CM15+1 >/CM15+2>/CM15+3>/CM15+4>/CM15+5>/CM15+6>/CM4+1>/CM15+7>/CM4+2>/CM15+8>/CM4+3 >/CM15+9>/CM4+4>/CM4+5>/CM4+6>/CM4+7>/CM4+8>/CM4+9 19032 0 R/CM12+1>/CM12+2>/CM12 +3>/CM12+4>/CM12+5>/CM12+6>/CM1+1>/CM12+7>/CM1+2>/CM12+8>/CM16+10>/CM1+3>/CM12 +9>/CM16+11>/CM1+4>/CM16+12>/CM1+5>/CM16+13>/CM1+6>/CM16+14>/CM1+7>/CM16+15>/CM1 +8>/CM16+16>/CM1+9>/CM16+17>/CM16+18>/CM16+19>/CM8++1>/CM8++2>/CM8++3>/CM8++ 4>/CM8++5>/CM8++6>/CM47+1>/CM47+2>/CM47+3>/CM47+4>/CM47+5>/CM47+6>/CM44+1>/ CM44+2>/CM44+3>/CM44+4>/CM44+5>/CM44+6>/CM44+7>/CM41+1>/CM41+2>/CM28+10>/CM41+3>/ CM28+11>/CM41+4>/CM28+12>/CM41+5>/CM28+13>/CM41+6>/CM28+14>/CM41+7>/CM28+15>/CM12+10>/ СМ12+11>/СМ12+12>/СМ12+13>/СМ12+14>/СМ 12+15>/CM12+16>/CM12+17>/CM12+18>/CM4++1>/CM12+19>/CM4++2>/CM4++3>/CM4++4>/CM4 ++5>/CM4++6>/CM4++7>/CM4++8>/CM4++9>/CM76+1>/CM12+20>/CM12+21>/CM12+22>/CM12 +23>/CM73+1>/CM70+1>/CM24+10>/CM24+11>/CM24+12>/CM24+13>/CM24+14>/CM24+15>/CM24+16>/CM24 +17>/CM4++10>/CM4++11>/CM4++12>/CM17++1>/CM17++2>/CM39+1>/CM39+2>/CM39+3>/CM39 +4>/CM39+5>/CM39+6>/CM39+7>/CM39+8>/CM39+9>/CM36+1>/CM36+2>/CM36+3>/CM36+4>/CM36 +5>/CM36+6>/CM36+7>/CM36+8>/CM36+9>/CM8+10>/CM8+11>/CM8+12>/CM8+13>/CM33+1>/CM8 +14>/CM33+2>/CM8+15>/CM33+3>/CM8+16>/CM33+4>/CM8+17>/CM33+5>/CM8+18>/CM33+6>/CM8 +19>/CM33+7>/CM33+8>/CM33+9>/CM36+10>/CM36+11>/CM36+12>/CM30+1>/CM30+2>/CM30+3>/CM30 +4>/CM30+5>/CM30+6>/CM30+7>/CM30+8>/CM30+9>/CM20+10>/CM8+20>/CM20+11>/CM8+21>/CM20 +12>/CM8+22>/CM20+13>/CM8+23>/CM20+14>/CM8+24>/CM8+25>/CM20+15>/CM8+26>/CM20+16>/CM20 +17>/CM20+18>/CM68+1>/CM13++1>/CM13++2>/CM13++3>/CM65+1>/CM65+2>/CM62+1>/CM62+2 >/CM4+10>/CM4+11>/CM4+12>/CM4+13>/CM4+14>/CM4+15>/CM4+16>/CM4+17>/CM4+18>/CM4+19 >/CM32+10>/CM32+11>/CM4+20>/CM4 +21>/CM4+22>/CM4+23>/CM4+24>/CM4+25>/CM4+26>/CM28+1>/CM28+2>/CM28+3>/CM28+4>/CM28 +5>/CM28+6>/CM28+7>/CM28+8>/CM28+9>/CM25+1>/CM25+2>/CM25+3>/CM25+4>/CM25+5>/CM25 +6>/CM25+7>/CM25+8>/CM25+9>/CM22+1>/CM22+2>/CM22+3>/CM22+4>/CM22+5>/CM22+6>/CM22 +7>/CM17+10>/CM22+8>/CM17+11>/CM22+9>/CM17+12>/CM17+13>/CM17+14>/CM17+15>/CM17+16>/CM17 +17>/CM17+18>/CM17+19>/CM9++1>/CM9++2>/CM9++3>/CM9++4>/CM9++5>/CM9++6>/ CM57+1>/CM57+2>/CM1>/CM2>/CM3>/CM4>/CM5>/CM6>/CM7>/CM8>/CM9>/CM54+1>/CM54+2>/CM54+3 >/CM54+4>/CM51+1>/CM51+2>/CM51+3>/CM29+10>/CM51+4>/CM29+11>/CM51+5>/CM29+12>/CM29+13 >/CM29+14>/CM29+15>/CM13+10>/CM13+11>/CM13+12>/CM13+13>/CM13+14>/CM13+15>/CM13+16>/CM13+17 >/CM13+18>/CM13+19>/CM5++1>/CM5++2>/CM5++3>/CM5++4>/CM5++5>/CM5++6>/CM5+ +7>/CM5++8>/CM5++9>/CM9+1>/CM9+2>/CM9+3>/CM9+4>/CM13+20>/CM9+5>/CM13+21> /CM9+6>/CM9+7>/CM9+8>/CM9+9>/CM17+1>/CM17+2>/CM17+3>/CM17+4>/CM17+5>/CM17+6> /CM17+7>/CM6+1>/CM17+8>/CM6+2>/CM17+9>/CM6+3>/CM6+4>/CM6+5>/CM6+6>/CM6+7> /CM6+8>/CM6+9>/CM14+1>/CM14+2>/CM14+3>/CM14+4>/CM14 +5>/CM14+6>/CM14+7>/CM3+1>/CM14+8>/CM3+2>/CM14+9>/CM3+3>/CM3+4 2277 0 R/CM3+5> /CM3+6>/CM3+7>/CM3+8>/CM3+9>/CM11+1>/CM11+2>/CM25+10>/CM11+3>/CM25+11>/CM11+4> /CM25+12>/CM11+5>/CM25+13>/CM11+6>/CM11+7>/CM25+14>/CM11+8>/CM25+15>/CM25+16>/CM11+9> /CM1++1>/CM49+1>/CM1++2>/CM49+2>/CM1++3>/CM49+3>/CM1++4>/CM49+4>/CM1++5> /CM49+5>/CM1++6>/CM49+6>/CM1++7>/CM1++8>/CM1++9>/CM46+1>/CM46+2>/CM46+3>/ CM46+4>/CM46+5>/CM46+6>/CM46+7>/CM9+10>/CM9+11>/CM9+12>/CM9+13>/CM43+1>/CM9+14>/ CM43+2>/CM9+15>/CM43+3>/CM9+16>/CM43+4>/CM9+17>/CM43+5>/CM9+18>/CM43+6>/CM9+19>/ CM43+7>/CM43+8>/CM37+10>/CM37+11>/CM40+1>/CM40+2>/CM40+3>/CM40+4>/CM40+5>/CM40+6>/ CM40+7>/CM40+8>/CM40+9>/CM21+10>/CM9+20>/CM21+11>/CM9+21>/CM21+12>/CM9+22>/CM9+23>/ CM21+13>/CM9+24>/CM21+14>/CM21+15>/CM21+16>/CM21+17>/CM21+18>/CM1++10>/CM1++11>/CM1++ 12>/CM1++13>/CM1++14>/CM1++15>/CM1++16>/CM14++1>/CM14++2>>> эндообъект 19029 0 объект > эндообъект 18989 0 объект > эндообъект 18986 0 объект > эндообъект 18984 0 объект > эндообъект 19036 0 объект > эндообъект 18981 0 объект > эндообъект 2279 0 объект > эндообъект 19033 0 объект > эндообъект 18980 0 объект > эндообъект 2276 0 объект > эндообъект 18977 0 объект > эндообъект 19030 0 объект > эндообъект 18996 0 объект > эндообъект 18995 0 объект > эндообъект 18997 0 объект > эндообъект 18998 0 объект > эндообъект 18999 0 объект > эндообъект 19000 0 объект > эндообъект 19001 0 объект > эндообъект 19002 0 объект > эндообъект 19003 0 объект > эндообъект 19004 0 объект > эндообъект 19005 0 объект > эндообъект 19006 0 объект > эндообъект 19007 0 объект > эндообъект 19008 0 объект > эндообъект 19009 0 объект > эндообъект 19010 0 объект > эндообъект 19011 0 объект > эндообъект 19012 0 объект > эндообъект 19013 0 объект > эндообъект 19014 0 объект > эндообъект 19015 0 объект > эндообъект 19016 0 объект > эндообъект 19017 0 объект > эндообъект 19018 0 объект > эндообъект 19019 0 объект > эндообъект 19020 0 объект > эндообъект 19021 0 объект > эндообъект 19022 0 объект > эндообъект 19023 0 объект > эндообъект 19024 0 объект > эндообъект 19025 0 объект > эндообъект 19026 0 объект > эндообъект 19027 0 объект > эндообъект 19028 0 объект > эндообъект 19035 0 объект > эндообъект 19032 0 объект > эндообъект 2277 0 объект > эндообъект 1213 0 объект > эндообъект 18975 0 объект > эндообъект 18976 0 объект > эндообъект 2046 0 объект >78]/P 2045 0 R/S/Link/Pg 1582 0 R>> эндообъект 2010 0 объект >48]/P 2009 0 R/S/Link/Pg 1582 0 R>> эндообъект 2132 0 объект >18]/P 2131 0 R/S/Link/Pg 1550 0 R>> эндообъект 2163 0 объект >43]/P 2162 0 R/S/Link/Pg 1550 0 R>> эндообъект 2225 0 объект >87]/P 2224 0 R/S/Link/Pg 1550 0 R>> эндообъект 2205 0 объект >72]/P 2204 0 R/S/Link/Pg 1550 0 R>> эндообъект 2161 0 объект >40]/P 2159 0 R/S/Link/Pg 1550 0 R>> эндообъект 2160 0 объект >38]/P 2159 0 R/S/Link/Pg 1550 0 R>> эндообъект 7135 0 объект >42]/P 7134 0 R/S/Link/Pg 4157 0 R>> эндообъект 18170 0 объект >79]/P 18167 0 R/S/Link/Pg 3794 0 R>> эндообъект 19769 0 объект > эндообъект 19774 0 объект > эндообъект 19776 0 объект > эндообъект 19778 0 объект > эндообъект 19779 0 объект > эндообъект 19783 0 объект > эндообъект 19785 0 объект > эндообъект 19786 0 объект > эндообъект 19787 0 объект > эндообъект 19789 0 объект > эндообъект 19790 0 объект > эндообъект 19791 0 объект > эндообъект 19793 0 объект > эндообъект 19795 0 объект > эндообъект 19797 0 объект > эндообъект 19800 0 объект > эндообъект 19798 0 объект > эндообъект 19802 0 объект > эндообъект 19803 0 объект > эндообъект 19807 0 объект > эндообъект 19809 0 объект > эндообъект 19810 0 объект > эндообъект 19812 0 объект > эндообъект 19814 0 объект > эндообъект 19815 0 объект > эндообъект 19816 0 объект > эндообъект 19820 0 объект > эндообъект 19824 0 объект > эндообъект 19826 0 объект > эндообъект 19829 0 объект > эндообъект 19831 0 объект > эндообъект 19834 0 объект > эндообъект 19838 0 объект > эндообъект 19839 0 объект > эндообъект 19841 0 объект > эндообъект 19843 0 объект > эндообъект 19844 0 объект > эндообъект 19845 0 объект > эндообъект 19846 0 объект > эндообъект 19847 0 объект > эндообъект 19848 0 объект > эндообъект 19849 0 объект > эндообъект 19854 0 объект > эндообъект 19859 0 объект > эндообъект 19862 0 объект > эндообъект 19865 0 объект > эндообъект 19868 0 объект > эндообъект 19876 0 объект > эндообъект 19879 0 объект > эндообъект 19881 0 объект > эндообъект 19883 0 объект > эндообъект 19855 0 объект > эндообъект 19890 0 объект > эндообъект 19891 0 объект > эндообъект 19892 0 объект > эндообъект 19894 0 объект > эндообъект 19895 0 объект > эндообъект 19902 0 объект > эндообъект 19906 0 объект > эндообъект 19908 0 объект > эндообъект 19910 0 объект > эндообъект 19912 0 объект > эндообъект 19913 0 объект > эндообъект 19914 0 объект > эндообъект 19915 0 объект > эндообъект 19917 0 объект > эндообъект 19919 0 объект > эндообъект 19921 0 объект > эндообъект 19923 0 объект > эндообъект 19927 0 объект > эндообъект 19928 0 объект > эндообъект 19930 0 объект > эндообъект 19931 0 объект > эндообъект 19933 0 объект > эндообъект 19938 0 объект > эндообъект 19940 0 объект > эндообъект 19942 0 объект > эндообъект 19945 0 объект > эндообъект 19949 0 объект > эндообъект 19952 0 объект > эндообъект 19956 0 объект > эндообъект 19958 0 объект > эндообъект 19960 0 объект > эндообъект 19959 0 объект > эндообъект 19771 0 объект > эндообъект 19747 0 объект >/Шрифт>/ProcSet[/PDF/Text/ImageB/ImageC]>>/Type/Page/LastModified(D:20110830082912-04’00’)>> эндообъект 3865 0 объект > эндообъект 19768 0 объект >поток HWkog ~kZ4=ز&-)FmmKIx }ϝ!Ç Y3yz)㫇*;>-To%spokenfYY)2d~8=ggV\ 2’4ch_f$j_a t.9 5|[email protected]>&mrKr’mrŧ@-% Ք\ʜXP4P [email protected]»z /C)S`W-j1]~M 5i»;(2=7″g

Оценка анти-IgA PT и IgG анти-ACT рефлекторное тестирование для улучшения серодиагностики Bordetella pertussis у недавно вакцинированных субъектов токсин (РТ) является наиболее специфичным и чувствительным методом серодиагностики инфекции

Bordetella pertussis .Поскольку PT является компонентом бесклеточных коклюшных вакцин, анти-PT IgG также индуцируется вакцинацией, что исключает серодиагностику коклюша, основанную исключительно на анти-PT IgG у недавно вакцинированных субъектов. Здесь мы стремимся определить дополнительные серологические маркеры, специфичные для B. pertussis-, которые могут различать инфекцию и недавнюю вакцинацию.

Методы

Клиническая полезность измерения IgA, направленного на вакцинный антиген PT, и IgG, направленного на невакцинные антигены (Fim2/3, LPS, ACT, CatACT), оценивалась в девяти хорошо охарактеризованных группах субъектов в возрасте 10–89 лет. ( n  = 390).Уровни анти-PT IgG в сыворотке (>125 МЕ/мл) служили индикатором недавней инфекции B. pertussis . Сравнение пациентов с симптомами коклюша ( n = 140) с недавно вакцинированными неинфицированными субъектами ( n = 100) выявило оптимальное отсечение, точность, чувствительность и специфичность для каждого отдельного параметра.

Результаты

При диагностике коклюша у недавно вакцинированных субъектов измерение анти-PT IgA (пороговое значение 15 МЕ/мл) и анти-ACT IgG (пороговое значение 15 ЕД/мл) дало точность 95% ( 91.5–97,1) и 87,5% (82,7–91,1), чувствительность 92,9% (87,4–96,0) и 83,6% (76,5–88,8), специфичность 98% (93,0–99,4) и 93% (86,3–96,6) соответственно. . Сравнение уровней анти-PT IgA между самой молодой (10–19 лет, n = 38) и самой старшей (70–89 лет, n = 17) возрастными группами выявило зависящее от возраста повышение уровня антител у больных коклюшем. испытуемых (р < 0,0001).

Выводы

Рефлекторное тестирование анти-PT IgA и анти-ACT IgG улучшает серодиагностику коклюша у недавно вакцинированных лиц с симптомами и повышенными уровнями анти-PT IgG.Кроме того, оба маркера могут различать вакцинацию и недавнюю инфекцию в исследованиях серологического надзора за коклюшем.

Ключевые слова

ключевые слова

ACT

Bordetella CONTUSSIS

IGA

IGA

CONTUSSIS TOXIN

Серодиагностиз

серология

вакцинация

Рекомендуемые статьи

© 2019 Европейское общество клинической микробиологии и инфекционные заболевания. Опубликовано Elsevier Ltd.

Ага, все еще убивает.Во второй раз за первые четыре недели Евролиги нападающий «Портленд Трэйл Блэйзерс» Николя Батум, играющий за SLUC Nancy во Франции, был удостоен звания MVP недели. Батум также был назван MVP недели 2.

Вот ролик с лучшими моментами Евролиги за 4-ю неделю через meru  на FanShots. Видео загружено пользователем YouTube Euroleague .

Вот подборка недавних похвал.

Кристофер Белак пишет в блоге Off The Dribble New York Times…

Завершив сезон карьеры в Портленде, а также хорошо выступив на Евробаскете этим летом, Николя Батум вернулся во Францию. Подписав контракт с SLUC Nancy, Батум в настоящее время является лидером по передачам и вторым бомбардиром Евролиги.

Барон фон Рупп  пишет на Technorati.com о триумфе Батума над французским клубом ASVEL, возглавляемым защитником «Сан-Антонио Сперс» Тони Паркером и центровым «Нью-Йорк Никс» Ронни Туриафом…

Хотя бывший «Портленд Трейлблейзер Батум» (21 очко, 6 подборов, 5 передач, 3 перехвата), безусловно, был главным событием, настоящая разница в игре заключалась в впечатляющей демонстрации организованности и командной игры гостей. В отличие от Паркера (20 очков за броски 6/21), который постоянно оставался один с баскетбольным мячом и четырьмя неподвижными товарищами по команде, Батум был просто лучшей частью динамичной машины для набора очков (Папе Амагу также был впечатляющим, набрав 20 очков всего за 25). минут включая 3/5 стрельбы из-за дуги).

20Minutes.FR назвал эту игру «Звездными войнами» и имеет хорошее изображение Батума и Туриафа.

Клэр Гудли на Bettor.com с кратким изложением результатов Батума в недавнем поражении от Фенербахче…

Николя Батум также показал сильную игру в многоборье с 22 очками, шестью передачами, шестью подборами и четырьмя перехватами; Адриан Моэрман сделал дабл-дабл с рекордными для игры 15 подборами и 11 очками, в то время как Джамал Шулер набрал 13 очков при бросках 2 из 2 с трехочковой дистанции.

«Фенербахче» реализовал 68,2% (28 из 41) с двухочковой дистанции, а «Нэнси» реализовал всего 50% (28 из 56). SLUC ошеломил Улкера в начале, когда Батум вышел вперед со счетом 5: 0.

ElMundo.ES имеет хорошее изображение данка Батума, а   отмечает , что у него было 21 очко, чтобы помочь SLUC Nancy обыграть Caja Laboral Vitoria, а SportMag.FR сообщает , что он добавил 9 подборов и 4 передачи.

Вот переведенная сводка AFP.

Нэнси, с огневой атакой и монументальным дуэтом Николя Батум / Акин Акингбала, сумела победить большую Виторию со счетом 90 до 85 (перерыв: 49-47) в четверг в 4-й день Баскетбольной Евролиги.

Этот успех, достигнутый благодаря тому, что Нэнси поднялась на четвертое место в группе А, позволяет больше, чем когда-либо, мечтать о попадании в Топ-16. Чемпионы Франции также послали сообщение всем своим соперникам: им будет очень трудно выиграть следующий этаж. .

Вот обзор игры с сайта Euroleague.net .

SLUC Нэнси одержала свою вторую победу в сезоне и принесла Caja Laboral первое поражение со счетом 90-85 в захватывающем противостоянии в группе A.Акин Акингбала набрал 26 очков, опередив Нэнси по результативности, в то время как Николя Батум набрал 21 очко, 9 подборов и 4 передачи, а Нэнси улучшила счет до 2-2.

Разница вернулась к девяти очкам менее чем через две минуты после двух бросков Моэрмана и двух штрафных из Батума, что сделало счет 82-73. Тайм-аут Laboral не помог, так как Батум вырвался вперед и вырвался вперед со счетом 84-73 менее чем за три минуты до конца игры. Рибас реализовал отрыв, чтобы остановить серию 8: 0, а затем Рибас ударил прыгуна, чтобы отступить в пределах 84-77.Телетович не позволил своей команде умереть и забил тройку, сделав игру с двумя владениями, 86-80. После того, как Батум выполнил один из двух штрафных бросков за 52 секунды до конца, Телетович также сделал всего один из двух пенальти, прежде чем Амагу забил гвоздь в гроб трехочковым из левого угла, сделав счет 90-81 за 26 секунд до конца. Серафин и Сан-Эметерио ударами сократили разрыв, но исход игры уже был решен.

Вот видео основных моментов победы над Caja Laboral от пользователя YouTube Euroleague .

Спасибо французскому корреспонденту Blazersedge Бруно за последние две ссылки.

— Бен Голливер | [email protected] | Твиттер

.